Validação de genes normalizadores em Echinococcus granulosus S.S (G1) e Echinococcus ortleppi para estudos de expressão gênica através de PCR em tempo real

Abstract

Recentemente, uma quantidade significativa de dados de sequência (tanto genômicas como transcritômicas) para Echinococcus spp. foi publicado, facilitando a análise de genes expressos durante um estágio especifico ou envolvidos no desenvolvimento do parasito. Para realizar uma análise adequada de quantificação da expressão gênica, o uso de genes de referência validados é fortemente recomendado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi identificar e validar genes de referência para permitir a normalização confiável da expressão gênica de determinados genes de interesse em Echinococcus granulosus sensu stricto (s.s.) (G1) e Echinococcus ortleppi durante o desenvolvimento inicial da forma pré-adulta do parasito. Protoescólices não tratados (PS) e protoescólices tratados com pepsina (PSP) do metacestódeo de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi foram usados para extração de RNA total e análise da expressão gênica. A estabilidade na expressão gênica de onze genes candidatos (TUB, NDUFV2, RPL13, TBP, CYP, RNApol sub2, EF-1α, βACT, GAPDH, ETIF4 e ERK) foi avaliada usando os programas geNorm, NormFinder e RefFinder. Nossos dados de RT-qPCR mostraram uma alta correlação com dados recentemente publicados de RNA-seq. Em relação à estabilidade na expressão, EF-1α e TBP foram os genes mais estáveis para ambas as espécies. Entretanto, βACT (gene comumente utilizado como normalizador), GAPDH e ETIF4 (previamente identificados como genes housekeeping) não tiveram um comportamento estável em nossas condições de ensaio. Desta maneira, propomos o uso de EF-1α como gene de referência para estúdios que envolvam análises de expressão gênica no inicio do desenvolvimento da forma pré-adulta de E. granulosus s.s. (G1) e E. ortleppi. Para demonstrar sua aplicabilidade, EF-1α foi usado como gene normalizador na quantificação relativa de transcritos para genes que codificam as proteínas ribossômicas L10, L14, e S15, e para as subunidades do antígeno B de E. granulosus. O mesmo gene de referência EF-1α poderia ser usado em estudos com outras espécies de Echinococcus sensu lato. Este é o primeiro relato que valida genes de referência adequados para a classe Cestoda, phyllum Platyhelminthes, portanto fornecendo uma base para futuras validações em espécies de cestódeos epidemiologicamente importantes, como aquelas do gênero Taenia.