Estudo funcional de genes do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae

Abstract

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é o entomopatógeno melhor caracterizado em nível molecular, em especial em relação a sua patogênese, principalmente pelo isolamento de genes diferencialmente expressos durante a infecção de hospedeiros. A infecção é um processo multifatorial complexo e os genes candidatos devem ser analisados funcionalmente. Para tal, uma das estratégias mais bem sucedidas é o desenvolvimento de sistemas para a geração de mutantes nulos por inativação gênica, mediada por recombinação homóloga. Neste trabalho, esta estratégia foi aplicada ao fungo M. anisopliae por intermédio da Agro-transformação. Inicialmente, padronizamos este sistema utilizando como alvo o gene trp1 deste fungo, envolvido no anabolismo do aminoácido triptofano. Obtivemos uma freqüência de recombinação homóloga em torno de 20 % para este locus. Como a integração do DNA exógeno é majoritariamente ectópica, nos valemos desta característica para construir uma biblioteca de mutantes de inserção e procedemos a uma caracterização preliminar de conídeos de mutantes morfológicos em relação a sua sensibilidade à radiação UV-A. Mostramos assim que este sistema é aplicável para o estudo funcional de genes no fungo. Dentre os prováveis fatores envolvidos no processo de infecção de M. anisopliae estão algumas hidrolases e o nosso grupo tem se dedicado a caracterização das quitinases neste fungo. As quitinases em particular são atraentes do ponto de vista de sua função, pois estão presentes em todos os fungos para o remodelamento da sua parede celular, composta por quitina, nos processos de crescimento e diferenciação, mas também nos processos de nutrição e patogênese. No sentido de estudar a função de um gene específico caracterizamos o gene chi3, o qual codifica para a quitinase bifuncional CHIT30. Clonamos a região 5´ flanqueadora e a análise in silico revelou a presença de possíveis elementos canônicos de regulação, dentre eles um associado à resposta ao choque térmico. Análises por qRT-PCR revelaram aumento dos níveis de transcritos do gene chi3 em condições de estresse térmico. Mutantes inativados deste gene foram gerados por Agro-transformação e os mesmos apresentaram menor produção de quitinases após o choque térmico e maior TL50 em bioensaios utilizando como modelo o inseto Dysdercus peruvianus. Para determinar a localização subcelular da quitinase CHIT30 foram gerados transformantes com um cassete para a expressão da proteína de fusão CHIT30 marcada com a proteína repórter GFP. Análises por microscopia confocal revelaram que a proteína de fusão está associada à parede celular, provavelmente seguindo a via de secreção de proteínas. Nossos resultados mostram que o gene chi3 apresenta regulação complexa. A expressão da quitinase CHIT30 de forma constitutiva parece ser letal e os mutantes nulos não demonstraram fenótipos claramente detectáveis em experimentos convencionais. O mutante Δchi3 apresentou eficiência diminuída na infecção do inseto D. peruvianus e a sua função na biologia do fungo é também complexa e ainda requer melhor detalhamento.

Metarhizium anisopliae is the best characterized enthomopathogenic fungus at the molecular level. The cloning of differentially expressed genes during the infection process is the main approach to study the infection process. The search for pathogenicity determinants has revealed that the process is complex and multifactorial. The characterization of putative genes related to the infection process has been made by the generation of null mutants via homologous recombination at the wild–type loci by using inactivation cassettes. In this work, we have developed a strategy for the generation of null mutants of the tryptophan anabolic gene trp1. Using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT), 22% efficiency of homologous recombination at the trp1 locus was achieved. Due to the high frequency of ectopic integration of the trp1 gene inactivation cassette, we applied this as a tool to generate an insertional library to isolate functional mutants. Morphological mutants were tested for their susceptibility to UV-A radiation. Therefore, we demonstrated the feasibility of this methodology in forward genetics studies in M. anisopliae. During fungal penetration through the host cuticle, hydrolases are tough to be crucial for infection consolidation. Chitinases are some of these enzymes and could be involved in cell wall modification or nutrient acquisition and pathogenicity. In order to contribute to the understanding of the role of specific chitinase genes in Metarhizium, we further characterized the CHIT30 chitinase encoding gene chi3. The 5´ upstream cloning and in silico analysis showed that some putative regulatory sequences are present, in particular a stress response element. Quantitative RT-PCR analysis detected an increase in chi3 transcripts during heatshock. ATMT gene inactivation was conducted for the chi3 gene. Mutants produced a lower level of chitinases during heat shock and were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. To uncover the subcellular localization of the CHIT30 chitinase, we have generated transformants to produce a GFP labelled CHIT30. Confocal microscopy analysis showed that the fusion protein was located at the cell wall. The chi3 gene possesses a complex regulation and the constitutive expression of the CHIT30 chitinase appears to be lethal. Null chi3 gene mutants were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. The function of this gene in virulence to insects is not clear. More studies will be necessary to fully understand the role of chitinases in fungi.