Avaliação da expressão gênica diferencial entre folhas e tecidos vasculares de Eucalyptus grandis

Abstract

No presente trabalho está descrita a análise de experimentos de microarranjos de DNA realizados pelos pesquisadores do Projeto GENOLYPTUS em conjunto com a empresa NimbleGen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), assim como a validação dos resultados gerados por essa análise, com a finalidade de encontrar genes diferencialmente expressos entre folhas e xilema de E. grandis para futuro estudo. O processo de análise dos microarranjos de DNA envolveu a busca por um software com programas estatísticos adequados ao estudo de grande quantidade de dados com mínima probabilidade de erro. A comprovação dos resultados gerados pelo software escolhido foi realizada com o uso da técnica da reação em cadeia da DNA-polimerase quantitativa (em tempo real) precedida de transcrição reversa (qRT-PCR). Alguns dos genes mais diferencialmente expressos foram selecionados para esta etapa, juntamente com alguns genes com expressão não tão alta. Os genes mais expressos nas folhas que foram escolhidos codificam para; (i) uma proteína semelhante à metalotioneína do tipo 3 (MT-3); (ii) uma glicolato-oxidase; (iii) uma catalase; (iv) uma fosforribulocinase precursora de cloroplasto (PRK); (v) um fator de transcrição MYB do tipo MYB142 e, (vi) uma proteína tipo “dedo-de-zinco”. Os genes mais expressos no xilema escolhidos foram os que codificam (i e ii) duas proteínas expressas em Arabidopsis thaliana; (iii) uma proteína hipotética expressa em Nicotiana benthamiana; (iv) uma descarboxilase de UDPglicuronato do tipo 2, (v) uma quitinase do tipo ELP; (vi) uma celulosesintase tipo 3; (vii) um fator de transcrição MYB; (viii) uma cafeoil-CoA-3- O-metiltransferase (CCoAOMT) e; (ix) uma proteína rica em prolina híbrida do tipo 2 (HyPRP2). Os resultados das qRT-PCRs demonstraram que o experimento de microarranjo e seus resultados foram consistentes e válidos, embora os primeiros tenham demonstrado valores de expressão freqüentemente mais altos. Acreditamos que tanto a análise dos microarranjos de DNA quanto a equivalência das amostras (duplicatas) biológicas estudadas foram totalmente sustentadas pelos resultados da qRT-PCR, pois foram robustas o suficiente para estimar um grande número de genes simultaneamente e indicar aqueles mais importantes como candidatos para futuras análises.

In the present work it is described the analysis of DNA microarray experiments developed by GENOLYPTUS researchers together with Nimblegen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), as well as the validation of the generated results with the aim to find differentially expressed genes between leaves and xylem tissue of E. grandis for further study. The DNA microarray analysis process comprised the search for software containing statistical programs satisfactory for studying an enormous amount of data with a very low false discovery rate. The confirmation of the generated data by the chosen software was made with the use of quantitative (real-time) reverse-transcription followed by polymerase chain reaction (qRT-PCR). Some of the most differentially expressed genes were selected for this step, along with some genes with average expression. Leaf chosen genes were those that codify (i) a metallothionein-like protein type 3 (MT-3), (ii) a glycolate oxidase, (iii) a catalase, (iv) a precursor phosphoribulokinase (PRK) from chloroplast, (v) a MYB transcription factor (MYB142), and (vi) a CONSTANS-LIKE 16 zincfinger protein. Xylem chosen genes were those codifying (i and ii) two expressed proteins from Arabidopsis thaliana, (iii) a hypothetic protein expressed in Nicotiana benthamiana, (iv) a putative UDP-glucuronate decarboxylase type 2, (v) a chitinase type ELP (ectopic deposition of lignin in pith), (vi) a cellulose synthase type 3, (vii) a MYB transcription factor, (viii) a caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase (CCoAOMT), and (ix) a hybrid proline-rich protein type 2 (HyPRP2). Our qRT-PCR results proved the full consistency and validation of the microarray experiments, although the relative expression ratios of the first were often higher. We believe that our microarray analysis as well as the equivalence of biological samples (duplicates) were fully supported by the qRT-PCR findings since they were robust enough to evaluate a massive number of genes and able to point out important candidate genes.