Neurobiologia dos transtornos de ansiedade em adolescentes : análise de polimorfismos do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal e do metiloma do DNA ao longo do tempo

Abstract

Introdução: A neurobiologia dos transtornos de ansiedade (TA) é complexa e envolve interações ambientais e genéticas ainda não conhecidas. Esses transtornos, comumente, iniciam durante a infância e adolescência, persistindo ao longo da vida. O comprometimento da resposta biológica frente ao estímulo estressor, encontrado em muitos pacientes com TA, sugere a influência do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA) nestes transtornos e, portanto, os polimorfismos associados ao eixo HHA poderiam ser estudados em genes candidatos. Os estudos que almejam entender a etiologia dos TA devem, também, explorar as alterações epigenéticas (incluindo a metilação do DNA) decorrentes das influências ambientais. Objetivos: Estudar, em adolescentes, polimorfismos genéticos funcionais do eixo HHA, interações Gene x Ambiente (G x A) e metiloma do DNA, considerando as diferentes trajetórias dos TA. Métodos: Foi realizada a extração de DNA das células do epitélio bucal de 228 adolescentes (131 casos e 97 controles para os TA) e foram genotipados, por PCR em tempo real, polimorfismos funcionais envolvidos com o eixo HHA (FKBP5: rs3800373, rs9296158, 3800373, rs9296158, 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 rs1360780, rs9470080 e rs4713916; NR3C1NR3C1 : rs6198;: rs6198;: rs6198; NR3C2NR3C2 : rs2070951;: rs2070951;: rs2070951; CRHR1CRHR1 CRHR1 : rs878886 : rs878886 e SERPINA6 SERPINA6 : rs746530) : rs746530) . Os participantes responderam à escala auto-aplicativa SCARED (Screen for Children Anxiety Related Emotional Disorder – Children rated) e realizaram entrevistas semiestruturadas para avaliação diagnóstica utilizando o K-SADS-PL (Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia for School-Age Children-Present and Lifetime). O questionário CTQ (Childhood Trauma Questionnaire) foi aplicado em 90 adolescentes (54 casos e 36 controles para os TA) para avaliar a interação entre o trauma emocional e o polimorfismo do gene NR3C2 nos níveis séricos de BDNF. Uma subamostra de adolescentes (n=47) foi reavaliada, cinco anos após a primeira coleta, através das mesmas entrevistas psiquiátricas e nova extração de DNA salivar. Alguns participantes, na última avaliação, responderam ao MINI (Mini International Neuropsychiatric Interview) apropriado para a idade atual. A amostra foi organizada em 4 grupos, conforme o diagnóstico dos TA e o ano da coleta de saliva (anos de 2008 e 2013): (1) Desenvolvimento típico da adolescência (Controle; n=14); (2) Incidentes para os TA (ITA; n=11); (3) Persistentes para os TA (Caso; n=14) e (4) Remitentes para os TA (RTA; n=08). O metiloma do DNA foi analisado com o Infinium HumanMethylation 450 BeadChip da Illumina. Resultados: Não foi encontrada associação entre os polimorfismos estudados e os TA. Em relação à interação G x A, sugere-se que o polimorfismo rs2070951 do gene NR3C2 modera a associação entre negligência física e os níveis séricos de BDNF. Do ponto de vista epigenético, foi observada, nos grupos ITA e RTA, vias biológicas com padrão homogêneo e relacionadas ao sistema nervoso. Já nos grupos casos e controles para os TA, foram evidenciadas vias biológicas com padrão mais heterogêneo. Um perfil de hipometilação do DNA foi predominante nas vias encontradas. Na análise transversal, nós encontramos padrões opostos de metilação do DNA, conforme o período desenvolvimental avaliado: hipometilação no início da adolescência e hipermetilação em jovens adultos. Conclusão: Esse estudo abordou, em uma amostra de adolescentes, aspectos genéticos (genes candidatos envolvidos com o eixo HHA), ambientais (trauma emocional) e epigenéticos (metiloma do DNA) dos TA. Os achados sugerem que, embora sem associações entre os TA e genes envolvidos no eixo HHA, existe uma interação entre a presença de trauma emocional, polimorfismo genético do eixo HHA e marcadores biológicos. Os achados do metiloma do DNA sugerem, também, influências epigenéticas no curso dos TA. Novos estudos devem ser delineados para corroborar as influências genéticas e ambientais neste transtorno.

Background: The neurobiology of Anxiety Disorders (AD) is complex and involves environmental and genetic interactions understood. These disorders may have their onset during childhood and adolescence, persisting throughout life. The impairment of biological response against the stressor stimulus, described in many patients with AD, suggests a possible role of genetic polymorphisms of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis in these individuals. Studies that aim to understand the etiology of AD should also explore the epigenetic changes (including DNA methylation) arising from environmental influences. Objective: To study, in adolescents, functional genetic polymorphisms of HPA axis, Gene x Environment (G x E) interactions and DNA methylome, considering different AD outcomes. Methods: Saliva DNA was extracted from 228 adolescents (131 cases and 97 controls to AD) and we genotyped, by real time PCR, the functional polymorphisms involved with HPA axis (FKBP5: rs3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; 3800373, rs9296158, rs1360780, rs9470080 and rs4713916; NR3C1NR3C1 : rs6198; : rs6198; : rs6198; NR3C2NR3C2 : rs2070951; : rs2070951; CRHR1CRHR1CRHR1 CRHR1: rs878886 and : rs878886 and : rs878886 and : rs878886 and SERPINA6 SERPINA6 SERPINA6SERPINA6 : rs746530) : rs746530) . Participants responded to the scale self-applied Screen for Children Anxiety Related Emotional Disorder – Children rated (SCARED) and were diagnosed according to the Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia for School-Age Children-Present and Lifetime (K-SADS-PL). The Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) was applied in 90 adolescents (54 cases e 36 controls to AD) to evaluate the interaction between emotional trauma and the NR3C2 polymorphism in the serum levels of BDNF. A sub-sample of adolescents (n = 47) was reassessed five years after the first evaluation by the same psychiatric semi-structured interviews and new extraction salivary DNA was performed. Some participants in the last evaluation responded to Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI), which is a semi structure interview appropriate for the present age. The sample was organized in four groups according to the diagnosis of AD and the year of saliva collection (2008 and 2013): (1) Typically Developing Controls (TDC; n = 14); (2) Incident Anxiety Disorder (IAD; n = 11); (3) Persistent Anxiety Disorder (PAD; n = 14); (4) Remittent Anxiety Disorder (RAD; n = 8). DNA methylome was evaluated with Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Results: We did not find any association between the genetic polymorphisms and AD. Considering the G x E interaction we suggest that rs2070951 polymorphism of NR3C2 gene moderates the association between physical neglect and serum BDNF levels. When we evaluated the DNA methylome, we observed more homogeneous biological pathways and mostly related with nervous system in individuals from IAD and RAD groups. On the other hand, in the TDC and PAD groups, we found biological pathways with a more heterogeneous pattern. A DNA hypomethylation profile was found predominant in the pathways. In a cross-sectional analysis, we found opposite patterns of DNA methylation, as the developmental period assessed: hypomethylation at the beginning of adolescence and hypermethylation in young adults. Conclusion: This study addressed, in an adolescent sample, genetics (candidate genes linked to HPA axis), environmental (emotional trauma) and epigenetic (DNA methylome) aspects of AD. The findings suggest that although there are no associations between AD and genes involved in HPA axis, there is an interaction between the presence of trauma, genetic polymorphism involved in this axis and biomarkers. The DNA methylome findings also suggest epigenetic influences on the course of TA. Further studies should be designed to corroborate the genetic influences in this disorder.