Detecção de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis em plantas de batata através de PCR com oligonucleotídeos iniciadores a partir das seqüências dos genes pnl e rdg

Abstract

A canela-preta, causada por Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis (Pcbr), está entre as principais doenças bacterianas da batata. Estudos epidemiológicos desta doença dependem de métodos eficientes de detecção. Como a principal característica das pectobactérias é a produção de enzimas pectolíticas em grande quantidade, os genes pnl e rdg, relacionados à pectina liase foram selecionados para a projeção de oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos para Pcbr. Os alinhamentos das seqüências de nucleotídeos dos genes pnl e rdg mostraram a existência de seqüências conservadas entre as estirpes de Pcbr, a partir das quais foram projetados os primers PcbrPnlF/ PcbrPnlR e PcbrRdgF/PcbrRdgR, que geraram produtos de 130 e 180 pb, respectivamente. Para a avaliação dos primers e métodos de extração de DNA Total, 10 hastes de plantas de batata com sintomas de canela-preta, foram coletadas de cada uma de quatro lavouras (Ágata: 3, Asterix: 1) no município de São Francisco de Paula, RS. Pcbr foi detectada através de PCR com PcbrRdgF/PcbrRdgR e DNA extraído por fervura e FTACard em 25 e 55% das amostras, e com PcbrPnlF/ PcbrPnlR em 12 e 45%, respectivamente. Estes resultados indicaram que os primers PcbrRdgF/PcbrRdgR foram mais eficientes, tanto na extração com FTACard (22%) quanto por fervura (108%). A detecção por PCR com ambos pares de primers foi maior quando o DNA foi extraído pelo método FTACard.

Blackleg, caused by Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis (Pcbr), is among the major bacterial diseases of potato. Epidemiological studies of this disease depend on efficient methods of detection. As the main trait of pectobacteria is the production of large amounts of pectolytic enzymes, genes pnl and rdg, related to pectin liase, were chosen to project primers specific to Pcbr. The nucleotide sequence alignments of the genes pnl and rdg showed the existence of conserved sequences among Pcbr strains. Primers PcbrPnlF/PcbrPnlR (130 bp product) and PcbrRdgF/PcbrRdgR (180 bp product) were designed based on them. To evaluate them and the total DNA extraction methods, 10 stems of potato plants, with blackleg, were harvested from each of four fields (Ágata: 3; Asterix: 1) in the São Francisco de Paula county, RS. Pcbr was detected through PCR with PcbrPnlF/ PcbrPnlR and PcbrRdgF/PcbrRdgR primers and DNA extracted by boiling and FTACard in 25 and 55%, and in 12 and 45% of stems, respectively. These results indicated the PcbrRdgF/PcbrRdgR primers were more efficient with DNA extracted by both boiling (108%) and FTACard (22%). Pcbr detection using both primer sets was higher with DNA extracted by FTACard method.