Diferenciação de células tronco mesenquimais a partir do meio condicionado da linhagem HepG2

Abstract

OBJETIVO: Examinar o efeito do meio condicionado da linhagem HepG2 nas célulastronco mesenquimais in vitro no que se refere à sua diferenciação em hepatócito. MATERIAIS E MÉTODOS: As CTM foram isoladas da medula óssea de ratas Wistar combinando a centrifugação por gradiente de densidade e a aderência à superfície de cultivo. As CTM foram cultivadas em meio de diferenciação osteogênico e adipogênico e coradas com Alizarin Red S e Oil Red-O respectivamente. Para induzir a diferenciação hepática, CTM foram cultivadas com 70% de meio condicionado de HepG2 ou com 50 ng/mL de fator de crescimento de hepatócito (HGF) durante 3 semanas. Foram realizadas RT-PCR e analises imunocitoquímica para marcadores de células-tronco (Thy-1) e marcadores hepáticos como ALB, AFP, CK-8 e CK-18. Adicionalmente foram realizadas colorações de Oil Red-O em CTM tratadas com meio condicionado de HepG2. RESULTADOS: Combinando a centrifugação por gradiente de densidade com a aderência à superfície de contacto, isolamos uma população homogênea de CTM nas quais as colorações de Alizarin Red S e Oil Red-O foram positivas quando tratadas. Logo de 3 semanas de tratamento, com meio condicionado de HepG2 ou HGF, não foram observados câmbios morfológicos nem expressão gênica (RT-PCR ou análise imunocitoquímica) para proteínas hepáticas (AFP, ALB, CK8 e CK18). A expressão de Thy-1 foi positivo antes e depois do tratamento em ambos grupos. Surpreendentemente as CTM tratadas com meio condicionado de HepG2 apresentaram acúmulos de lipídeos perinucleares corados com Oil Red-O. Estes acúmulos de gordura foram distintos às observados nas CTM tratadas com meio adipogênico, mas seu fenótipo foi similar às células HepG2 quando coradas com o mesmo método. CONCLUSÕES: Apesar de que o meio condicionado de HepG2 não foi capaz de induzir a diferenciação de CTM a hepatócitos, ele tem algum efeito sobre as CTM conduzindo a um fenótipo que se assemelha a uma esteatose microgoticular.

AIM: In the present study, we examined the effect of conditioned medium from the HepG2 cell line upon mesenchymal stem cells and their ability to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro. METHODS: MSCs were isolated from bone marrow of Wistar rats by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and analyzed by Alizarin Red S and Oil Red-O staining. To induce hepatic differentiation, MSC were cultured with 70% of HepG2-CM or with 50 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) for 3 weeks. RT-PCR and immunocytochemistry analysis for the stem cell marker Thy-1 and hepatic markers, ALB, AFP, CK-8 and CK-18 were performed. In addition, Oil Red-O and Alizarin Red S staining were also performed in the MSC treated with HepG2-CM. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of MSC and differentiated them into osteocytes and adipocytes. After 3 weeks of treatment no changes in morphology were observed in either group (HepG-CM or HGF). RT-PCR and antibody staining for hepatic proteins (AFP, ALB, CK8 and CK18) were also negative. Expression of Thy-1, a marker of mesenchymal stem cell was positive both before and after treatment in both groups. Surprisingly MSC treated with HepG2-CM for 3 weeks presented lipid droplets that were stained with Oil Red-O. These droplets were very distinct from the ones observed in MSC treated with adipogenic medium but resembled those seen in HepG2 cells stained by the same method. CONCLUSIONS: However, HepG2-CM was not able to induce differentiation of MSC in a hepatocyte-like, they had an effect upon MSC leading to a phenotype resembling mild steatosis.