Bases estruturais e dinâmicas de biomoléculas na via de N-glicosilação em bactérias

Abstract

A N-glicosilação é uma modificação co- ou pós-traducional distribuída de forma abundante nos domínios da vida, e é caracterizada pelo reconhecimento de uma assinatura N-X-S/T nas proteínas-alvo. Os dois últimos passos para essa via biossintética são a translocação do oligossacarídeo ligado ao lipídio (LLO) para o periplasma e a transferência em bloco da cadeia glicídica para a asparagina da assinatura de N-glicosilação, sendo realizada pela flipase PglK (Bacteria) e oligossacariltransferases (OSTs) PglB (Bacteria), respectivamente. Dados cristalográficos para essas enzimas identificaram suas divisões em subunidades estruturais. Para PglK, que faz parte da família dos transportadores ABC, foram identificados o domínio de ligação ao nucleotídeo (NBD), o domínio transmembrana (TMD) e a hélice externa (EH). O domínio TMD é essencial para a translocação do substrato e a EH parece desempenhar uma papel crucial nesse processo. Na PglB foram descritos o núcleo central (CC), a sequência inserida (IS) e a periferia (P1 e P2). A unidade CC é fundamental para a interação com o substrato e para a catálise. Em decorrência do emprego desses sistemas enzimáticos em glicoengenharia de proteínas e no desenvolvimento de vacinas, a compreensão da origem estrutural para suas propriedades catalíticas e para a seletividade por substratos pode contribuir diretamente para o desenvolvimento de novas aplicações tecnológicas. Nesse âmbito, a presente tese avalia aspectos estruturais e conformacionais de tais macrobiomoléculas da via de N-glicosilação em bactérias, assim como a potencial elucidação do mecanismo de translocação catalisado pela flipase. Para tanto, primeiramente, empregamos a técnica de dinâmica molecular (DM) na PglB de Campylobacter lari e observamos a plasticidade conformacional do sítio ativo desta, com variações em elementos importantes, como a alça externa 5 (EL5) e os resíduos catalíticos, sob influência da complexação dos substratos. Para os LLOs dos três domínios da vida, uma abordagem utilizando cálculos em ab initio e DM foi utilizada para a parametrização da subunidade isoprenóide, obtendo novos potenciais torcionais, que reproduziram corretamente as propriedades experimentais. A DM do LLOs demonstrou uma preferência clara das cadeias sacarídicas pela posição paralela em relação à bicamada lipídica e o LLO de bactérias apresentou uma orientação necessária para a complexação com a PglB e a PglK. Os estudos de DM da flipase PglK de Campylobacter jejuni permitiram a elucidação do resíduo de arginina (R309) responsável por iniciar a complexação com o pirofosfato do LLO além de verificar a alta flexibilidade da EH e a complexação com o substrato. Após a complexação com o substrato, foi realizada uma metodologia de amostragem ampliada, chamada metadinâmica, que permitiu a elucidação de uma parte do processo de translocação do LLO catalisado pela PglK e, assim, a elaboração de uma nova proposta para o mecanismo de "flip". Nesse sentido, a presente tese esclareceu importantes aspectos estruturais e funcionais de biomoléculas na via de N-glicosilação, oferecendo suporte para o planejamento de novos experimentos e de aplicações tecnológicas. As novas informações sobre o mecanismo da PglB e PglK podem auxiliar no desenvolvimento de glicoproteínas portando monossacarídeos específicos, potencialmente úteis para a produção de vacinas e de outras biomoléculas com uso terapêutico.

N-glycosylation is a post-translational or co-translational modification abundantly distributed in all life domains, which is characterized by the recognition of an N-X-S/T signature on the target proteins. The last two steps of this biosynthetic pathway are the translocation of the lipid-linked oligosaccharide (LLO) to the periplasm and block transfer of the glycidic chain to the asparagine of the N-glycosylation signature, being performed by flippase PglK (Bacteria) and oligosaccharyltransferases (OSTs) PglB (Bacteria) respectively. Crystallographic data for these enzymes have identified their structural subunits. For PglK, an ABC transporter, the nucleotide binding domain (NBD), the transmembrane domain (TMD) and external helix (EH) were identified. TMD domain is essential for substrate translocation and EH seems to play a crucial role in this process. In the PglB, the central nucleus (CC), the inserted sequence (IS) and the periphery (P1 and P2) were described. The CC unit is fundamental for interaction with the substrate and catalysis. As a result of the use of these enzymatic systems in protein glycoengineering and in the development of vaccines, the understanding of the structural origin for its catalytic properties and for the substrate selectivity can contribute directly to the development of new technological applications. In this context, the present thesis evaluates structural and conformational aspects of these biomolecules of the N-glycosylation pathway in bacteria, as well as the potential elucidation of the mechanism of flippase-catalyzed translocation. To do so, we first used the molecular dynamics (MD) technique in the Campylobacter lari PglB where we observed the conformational plasticity of the active site of PglB, with variations in important elements, such as external loop 5 (EL5) and catalytic residues under influence of the substrate complexation. For the LLOs from the three domains of life, an approach using ab initio and MD calculations was used for the parameterization of the isoprenoid subunit, obtaining new torsional potentials, which correctly reproduced the experimental properties. The MD of the LLOs demonstrated a clear preference of the saccharide chains for a parallel position in relation to the lipid bilayer, the LLO from bacteria showed a necessary orientation for the complexation with PglB and PglK. The MD studies of Campylobacter jejuni PglK flippase allowed for the elucidation of arginine residue (R309) responsible for initiating complexation with LLO pyrophosphate; observation of the high flexibility of the EH and the complexation with the substrate. After complexation with the substrate, an enhanced sampling methodology, metadynamics, was carried out, which allowed the elucidation of a part of the LLO translocation process catalyzed by PglK and thus the elaboration of a new proposal for the flip mechanism. In this sense, the present thesis has clarified important structural and functional aspects of biomolecules in the N-glycosylation path, offering support for the planning of new experiments and technological applications. Elucidation on the mechanism of PglB and PglK can help in the development of glycoproteins carrying specific monosaccharides, which are potentially useful for the production of vaccines and other biomolecules with therapeutic use.