Estudo da associação entre genótipo e fenótipo na deficiência de biotinidase

Abstract

A deficiência de biotinidase (DB) é uma doença autossômica recessiva na qual estão prejudicadas a obtenção da vitamina biotina a partir da dieta e a reciclagem da mesma, levando à deficiência de carboxilases dependentes de biotina. As manifestações clínicas incluem problemas neuropsicomotores, dermatológicos e metabólicos. O diagnóstico da DB pode ser feito a partir de triagem neonatal, sendo que a confirmação é dada pela medida da atividade da biotinidase sérica. A DB pode ser total (atividade da biotinidase <10%) ou parcial (atividade da biotinidase entre 10-30%). O gene que codifica a biotinidase, BTD, é composto por 44kb, e alguns genótipos específicos foram associados com determinados fenótipos bioquímicos (ou classes enzimáticas: DB total, DB parcial, heterozigoto, normal). Entretanto, podem ser verificadas discordâncias entre o fenótipo esperado de acordo com o genótipo e o fenótipo de fato observado. Além disso, há controvérsias em relação aos benefícios da triagem e tratamento preventivo da forma parcial da deficiência. Objetivo: Este trabalho teve por objetivo estudar a associação entre genótipo e fenótipo na DB. Métodos: Etapa 1) Sequenciamento do gene BTD (região promotora, 5’UTR, éxons 1 a 4 e avaliação de fatores não genéticos relacionados à atividade da biotinidase em 72 indivíduos com atividade reduzida da biotinidase. Etapa 2) Estudo funcional de variantes gênicas descritas pela primeira vez por Borsatto et al. (2014, 2017) (c.119T>C, c.479G>A, c.664G>A, e c.1337T>C e c.1466A>G) e da variante mais comum na DB (c.1330G>C). Etapa 3) Avaliação de metabólitos (ácidos graxos, aminoácidos, colesterol total, triglicerídeos, glicose e insulina) em plasma de 14 pacientes com DB parcial e de 19 controles, na busca de evidências que reforçariam a indicação de tratamento na DB parcial. Resultados: Etapa 1) Foram identificadas três variantes novas (c.1337T>C, c.1466A>G e c.962G>A). A concordância entre o fenótipo bioquímico esperado (conforme genótipo) e o observado ocorreu em aproximadamente 70% dos casos. As variantes encontradas na região promotora (c.-514C>T, c.-315A>G e c.-183G>A), icterícia neonatal, prematuridade e transporte da amostra de plasma parecem não ter sido as principais causas das discordâncias entre fenótipo esperado e fenótipo observado. A atividade da biotinidase pode aumentar entre a primeira e 12 segunda coleta (período neonatal). A inconsistência na associação genótipo-fenótipo bioquímico reforça a orientação de que a DB deve ser diagnosticada com base na medida da atividade da biotinidase. A análise genética tem utilidade principalmente na diferenciação entre DB parcial e heterozigose. Etapa 2) Os resultados sugerem que as variantes novas c.119T>C, c.479G>A e c.1337T>C são deletérias, e que as variantes c.664G>A, c.1466A>G e c.1330G>C não são deletérias. Apesar disso, a variante c.1466A>G pode estar associada a DB parcial e o mecanismo de patogenicidade da c.1330G>C pode estar relacionado à instabilidade da enzima. Etapa 3) Dentre os analitos pesquisados, não foram identificadas alterações metabólicas em indivíduos com DB parcial e, portanto, o estudo falhou em mostrar evidências que reforcem o caráter patogênico da DB parcial.

Biotinidase deficiency (BD) is an autosomal recessive disorder in which both absorption of biotin from dietary sources and its reuse/recycle are impaired, leading to a deficiency of biotin-dependent carboxylases. Clinical manifestations include neurological, dermatological and metabolic abnormalities. The diagnosis of BD can be made by neonatal screening, and the confirmation is given by the measurement of serum biotinidase activity. BD may be profound (biotinidase activity <10%) or partial (biotinidase activity between 10-30%). The gene that codes for biotinidase, BTD, comprises 44kb, and some genotypes correlate with certain biochemical phenotypes (or enzymatic classes: total DB, partial DB, heterozygous, normal). However, disagreements between the expected phenotype (according to genotype) and observed phenotype can be seen. In addition, there are controversies regarding the benefits of screening and preventive treatment of the partial form of BD. Objective: The objective of this thesis was to study the association between genotype and phenotype in BD. Methods: Step 1) Sequencing of BTD gene (promoter region, 5'UTR and exons 1 to 4 and the evaluation of non-genetic factors related to biotinidase activity in 72 individuals with reduced biotinidase activity. Step 2) Functional study of novel genetic variants described by Borsatto et al. (2014, 2017) (c.119T>C, c.479G>A, c.664G>A, c.1337T>C and c.1466A>G) and the most common variant in BD(c.1330G>C). Step 3) Evaluation of metabolites (fatty acids, amino acids, total cholesterol, triglycerides, glucose and insulin) in plasma samples of 14 patients with partial BD and 19 control individuals, in order to search for evidences that would reinforce the indication of treatment in partial BD. Results: Step 1) Three novel variants were identified (c.1337T>C, c.1466A>G e c.962G>A). The agreement between the expected and the observed biochemical phenotype occurred in approximately 70% of cases. The variants found in the promoter region (c.-514C>T, c.-315A>G and c.-183G>A), neonatal jaundice, prematurity, and transport of the plasma sample were not the major causes of disagreement between expected and observed phenotype. Biotinidase activity may increase between the first and second collection (neonatal period). The inconsistency in the genotype-biochemical phenotype association reinforces the orientation that the BD should be diagnosed based 14 on the measurement of biotinidase activity. Genetic analysis has utility mainly in the differentiation between partial BD and heterozygosis. Step 2) The results suggest that the novel variants c.119T>C, c.479G>A and c.1337T>C are deleterious, and that the c.664G>A, c.1466A>G and c.1330G>C variants are not deleterious. Despite that, the c.1466A>G variant may be associated with partial DB and the mechanism of pathogenicity of c.1330G>C may be related to enzyme instability. Step 3) No metabolic changes were verified in individuals with partial BD, therefore the study failed to show evidence to reinforce the pathogenicity of partial DB.