Modulação da resposta de dano ao DNA e da autofagia em células tumorais expostas ao tratamento com quimioterápicos

Abstract

A resposta de dano ao DNA (DDR) é um conjunto de vias capazes de orquestrar o manejo de lesões no DNA provocadas por agentes endógenos ou exógenos. A ativação da DDR pode ocorrer em células tumorais em resposta ao tratamento com fármacos quimioterápicos. Neste cenário, após o reconhecimento do dano e transdução do sinal, diversos mecanismos podem ser ativados nas células, como a parada no ciclo celular, o reparo do dano, a autofagia, ou a morte celular. Em casos nos quais os danos não são suficientes para levar à morte da célula tumoral, a ativação das outras vias pode levar à resistência ao fármaco. Desta forma, uma modulação destas respostas pode auxiliar na investigação das causas da resistência e otimizar o efeito dos quimioterápicos no tratamento de tumores. Neste trabalho, demonstrou-se a ativação da DDR por dois fármacos pertencentes ao grupo das Ecteinascidinas (ETs), trabectedina (Yondelis®) e lurbinectedina (PM01183). A fim de se investigar o efeito da modulação do início da DDR, foram utilizados inibidores das vias das cinases ATM e ATR em células de câncer cervical e de câncer de ovário tratadas com as ETs. Foi encontrado que somente a inibição dual das cinases pode reduzir de maneira expressiva a viabilidade destas células. Em células de câncer cervical, esta redução na viabilidade ocorre por diminuição na formação de foci de proteínas do início da DDR (γH2AX e MDC1) e de proteínas do reparo por recombinação homóloga (BRCA1 e Rad51). O aumento no número de mitoses aberrantes também foi encontrado nas mesmas condições de tratamento, confirmando a necessidade de inibição dual de ATM e ATR para a sensibilização destas células. Nesta tese também se investigou o papel da autofagia em células de câncer colorretal tratadas com oxaliplatina (Ox) em condições de baixa disponibilidade de glicose. A baixa concentração de glicose é uma característica presente no microambiente tumoral que pode conferir resistência às terapias convencionais. Ao compararmos células tratadas em baixa ou alta concentração de glicose, foi encontrado um aumento na ativação da autofagia, acompanhado de uma maior sobrevivência celular em células tratadas com Ox em baixa glicose. O papel da autofagia nesta possível resistência à condição de baixa glicose foi analisado por modulação 12 gênica e farmacológica. Encontrou-se que o silenciamento do gene ATG7, essencial para o via autofágica, reduziu a ativação de autofagia em células tratadas em baixa glicose, porém não foi suficiente para reduzir a viabilidade celular, indicando que o mecanismo de resistência à baixa glicose é parcialmente independente da autofagia. Entretanto, em células tratadas com o indutor de autofagia rapamicina, foi encontrada uma queda na viabilidade celular, sugerindo que a super estimulação da autofagia pode ser uma ferramenta na sensibilização de células de câncer colorretal ao tratamento com Ox. Assim, a modulação da DDR e da via autofágica, vias que são ativadas na presença de quimioterápicos, pode ser uma ferramenta válida para a sensibilização de células de câncer e conferir uma melhor resposta ao tratamento.

The DNA damage response (DDR) is a group of pathways that orchestrate the management of DNA lesions caused by endogenous and exogenous agents. DDR activation can occur in tumor cells in response to chemotherapy. In this scenario, after the damage recognition and signal transduction, several outcomes can be activated within the cells, such as cell cycle arrest, DNA repair, autophagy, or cell death. In cases the damage cannot lead to tumor cell death, the activation of other pathways may lead to drug resistance. Therefore, a modulation of these responses helps in investigating the causes of resistance and can optimize the effects of chemotherapeutical agents in the treatment of tumors. In this work, we demonstrated the activation of DDR by two Ecteinascidins (ETs), trabectedin (Yondelis®) and lurbinectedin (PM01183). To investigate the effect of modulating the initial steps of DDR, ATM and ATR kinases inhibitors were used in cervical and ovarian cancer cells treated with ETs. It was found that only dual inhibition of the kinases can expressively reduce cell viability. In cervical cancer cells, this reduction in cell viability is due to a decrease in foci formation of proteins found in DDR initial steps (γH2AX and MDC1), and proteins of homologous recombination 13 repair (BRCA1 and Rad51). Aberrant mitosis was also increased in the same treatment conditions, confirming the requirement of dual inhibition of ATM and ATR to sensitize these cells. In this thesis, we also investigated the role of autophagy in colorectal cancer cells treated with oxaliplatin (Ox) in low glucose conditions. Low glucose is a feature of the tumor microenvironment that can confer resistance to conventional therapies. In comparison to cells treated in high glucose conditions, it was found an increase in autophagy activation, followed by increased cell viability in cells treated in low glucose. The role of autophagy in the possible resistance to low glucose condition was assessed by genetic and pharmacological modulation. Silencing of ATG7, an essential autophagy gene, decreased autophagy activation in cells treated under low glucose conditions, but was not enough to decrease cell viability, suggesting that the resistance mechanism in low glucose is partly independent of autophagy. Meanwhile, in cells treated with the autophagy inducer rapamycin, reduction in cell viability was observed, suggesting that autophagy overstimulation may be a useful tool to sensitize colorectal cancer cells to Ox. Therefore, modulation of DDR and autophagy, pathways that are activated in the presence of chemotherapeutical agents, can be a useful tool to sensitize cancer cells and provide a better response to treatment.