Estudos epidemiológicos, genéticos e avaliação de vacinas para pestivírus de ruminantes

Abstract

Os pestivírus de ruminantes causam significativas perdas econômicas em todo mundo. A infecção pode ser desde subclínica até fatal. Os sinais clínicos são diversos e podem acometer o trato respiratório, gastrointestinal e reprodutivo. As quatro espécies virais principais que causam estas infecções pertencem à família Flaviviridae, gênero Pestivirus, são elas: Pestivirus A, Pestivirus B, Pestivirus D e Pestivirus H. No entanto, elas são comumente chamadas de: vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), tipo 2 (BVDV-2), vírus da doença da fronteira (BDV) e HoBi-like pestivírus, respectivamente. Cada uma destas espécies pode ainda ser dividida em vários subgenótipos ou grupos genéticos. Essa grande diversidade genética e antigênica tem implicações no diagnóstico e na eficiência de vacinas. Deste modo, a presente tese objetivou realizar estudos epidemiológicos, genéticos, evolutivos e de vacinas contra pestivírus de ruminantes, com foco nas espécies detectadas no Brasil e Estados Unidos. No Capítulo 1, a diversidade genética de pestivírus foi investigada em ruminantes do Rio Grande do Norte e Maranhão através de RT-PCR do soro de animais amostrados para monitoria da febre aftosa. O HoBi-like pestivírus foi a única espécie viral detectada em bovinos, mas nenhum pestivírus foi detectado em pequenos ruminantes. No Capítulo 2, cinco HoBi-like pestivírus brasileiros tiveram o seu genoma completo sequenciado. Análises filogenéticas, genéticas e evolutivas foram realizadas de todos os HoBi-like pestivírus com genoma completo disponível no GenBank. Essas análises revelaram que o gene da glicoproteína E2 é o que mais varia e o que mais sofre seleção positiva. As cepas brasileiras são geneticamente mais relacionadas às cepas europeias e às detectadas em soro fetal bovino. Os resultados também sugerem que o HoBi-like pestivírus pode ter se originado na Índia e, posteriormente, foi introduzido no Brasil e, deste, foi levado para a Europa. No Capítulo 3, a prevalência de animais positivos para anticorpos contra pestivírus foi determinada em ovinos do estado do Wyoming, Estados Unidos. A porcentagem geral de animais soropositivos foi de 5,6%, apresentando variações regionais. Esse inquérito também indicou que a maioria dos animais soropositivos tinham sido infectados por BVDV-1. O Capítulo 4 teve como objetivo avaliar o fitness viral de isolados de BVDV-1a, BVDV-1b e BVDV-2a através da técnica de PrimeFlow RNA in vitro. Uma exclusão competitiva foi observada, pois, cepas de BVDV-2a excluíram cepas de BVDV-1a e BVDV-1b em coinfecções. Estes resultados foram semelhantes aos observados com as mesmas cepas in vivo, concluindo-se que o fitness viral pode ser avaliado com vantagens in vitro. O Capítulo 5 teve como objetivo avaliar a resposta humoral induzida por vacinas de replicon (Vrep) baseadas em cepas de BVDV-1a, BVDV-1b e BVDV-2a frente a 26 cepas pertencentes a sete subgenótipos. As três Vreps induziram anticorpos neutralizantes contra todas as cepas, contudo, os animais vacinados com a BVDV-1b Vrep e com uma vacina com vírus vivo modificado geraram títulos maiores do que aqueles vacinados com BVDV-1a e BVDV-2a Vrep. Os resultados destes 5 capítulos acrescentam conhecimentos sobre a diversidade, evolução, biologia e vacinas contra os pestivírus que serão importantes para aumentar a nossa habilidade de detectar e controlar esses vírus em programas de controle e erradicação.

The ruminant pestiviruses lead to major economic losses worldwide. The infection could be subclinical or even fatal. The clinical signs are diverse and may be present in the respiratory, gastrointestinal and reproductive tract. The four major viral species that cause this infection belong to the family Flaviviridae, pestivirus genus, which are: Pestivirus A, Pestivirus B, Pestivirus D e Pestivirus H. However, they are formerly known as: bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), type 2 (BVDV-2), border disease virus (BDV) and HoBi-like pestivirus, respectively. Besides, each species can be further segregated in several subgenotypes or genetic groups. This great genetic and antigenic variability have implications in the diagnostic and vaccines efficacy. Thus, the current thesis aimed to perform epidemiologic, genetic and evolutive studies on ruminant pestivirus, focusing on those detected in Brazil and the Unites States. In addition, this thesis aimed the development and evaluation of vaccines for pestivirus. In the first study, the genetic diversity of pestivirus was investigated in ruminants from Rio Grande do Norte e Maranhão States. All isolates were classified as HoBi-like pestivirus. All small ruminant samples tested negative. In the second study, genome of five Brazilian HoBi-like pestiviruses were sequenced. Beyond that, phylogenetic, genetic and evolutive analyses were performed based on all HoBi-like pestivirus, whose full-length genome sequences were available in a public database. The surface glycoprotein E2 encodes the most variable gene which also shows the greater number of sites under positive selection. The phylogenetic analysis also shows that Brazilian strains are closely related to European ones and those detected as fetal bovine serum contaminant. Phylogenetic inference suggests the HoBi-like pestivirus may have originated in Asia, specifically in India, and after it was introduced in Brazil and later spread to Europe. In the third study, the pestivirus antibody prevalence was assessed in sheep from Wyoming State, United States. The overall seroprevalence was 5.6%, which varied between geographic regions within the state. It was suggested that sheep flocks were likely exposed to BVDV-1. The fourth study aimed to evaluate the competitive fitness of BVDV-1a, BVDV-1b and BVDV-2a strains in vitro using the PrimeFlow RNA assay. Competitive exclusion was observed as the BVDV-2a strains dominated and eliminated the BVDV-1a and BVDV-1b strains in coinfections. The fifth study assessed the humoral immune response induced by virus replicon (Vrep) vaccines based on BVDV-1a, 1b and BVDV-2a strains against 26 representative BVDV strains of seven subgenotypes. The three Vrep vaccines induced neutralizing antibodies against all strains. However, the BVDV-1b-Vrep vaccinated animals had higher titers than those vaccinated with BVDV-1a and BVDV-2a Vrep and similar to those elicited by a modified-live virus (MLV) vaccine. The results presented herein add knowledge on diversity, evolution and biology of pestiviruses, which are essential to improve the ability to detect and control these viruses. Thus, it can support eradication and control programs.