Efeito da hipóxia na proliferação, apoptose e expressão de genes de pluripotência de células-tronco mesenquimais da polpa de dentes decíduos humanos

Abstract

A capacidade de diferenciação em diversos tipos celulares e a facilidade na obtenção com o mínimo de dano invasivo ao doador tornam as células-tronco provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados urna promessa para a engenharia de tecidos. No entanto, a pequena quantidade de células isoladas da polpa de dentes decíduos humanos é um dos principais obstáculos para a terapia celular, em que um grande número de células é crucial. A tentativa de aprimorar o microambiente da cultura celular, para promover uma expansão que comporte a aplicabilidade clínica, é um passo importante para a pesquisa e para o futuro da engenharia tecidual. O presente estudo teve por objetivo avaliar o efeito da hipóxia (3% de oxigênio) na proliferação, apoptose e pluripotência de células-tronco mesenquimais provenientes da polpa de dentes decíduos exfoliados (SHEDs). Primeiramente, foi realizada urna revisão de literatura abordando os conceitos de hipóxia, bem como o seu efeito sobre o cultivo das células-tronco com origem em tecidos dentais. O artigo original apresentou a caracterização de SHEDs (n=5), de acordo com a Sociedade Internacional de Terapia Celular. Para avaliação da atividade metabólica, o ensaio de WST -8 foi realizado após 1, 3, 5, 7 e 14 dias de cultivo em hipóxia ou normóxia. O uso do anticorpo Ki67 foi utilizado para analisar a proliferação em citômetro de fluxo. A análise da apoptose foi mensurada com Annexin V I iodeto de propídeo após 1, 4 e 7 dias, nos grupos hipóxia e normóxia. A expressão de genes relacionados à pluripotência celular (Oct4, Sox2 e Nanog) foi mensurada através de PCR quantitativo após 24 horas e 7 dias. Para a comparação estatística entre os grupos, o teste t de Student foi aplicado. Não foram observadas diferenças entre a atividade metabólica, apoptose e proliferação das SHEDs cultivadas em normóxia ou hipóxia (p>0,05). O ensaio de WST-8 demonstrou o crescimento exponencial para todas as culturas, no período analisado. A maior fração de células em proliferação foi observado no quarto dia de análise em ambos os grupos, sendo que foi observada uma reduzida fração de células mitóticas nos dias 1 e 7. A expressão de Oct4, Sox2 e Nanog foi significantemente maior no grupo hipóxia (p<0,01). Esses achados apontam o aumento nos marcadores de pluripotência, possibilitando a maior capacidade de diferenciação celular, como a principal vantagem do cultivo das SHEDs em situação de hipóxia.

Stem cells from exfoliated deciduous teeth are a promising source of cells for tissue engineering due to their possibility of differentiation into many cell types and their isolation abilities with minimal damage to the donor. However, the small quantity of isolated cells from tooth pulp is a major obstacle for cellular therapy. To improve the microenvironment o f the cell culture for promoting expansion is an important step for tissue engineering research. This study has aimed to evaluate the effect ofhypoxia (3% oxygen) in the proliferation, apoptosis and pluripotency of mesenchymal stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHEDs). Firstly, a review of the Iiterature addressing concepts o f hypoxia and its effect on stem cells derived from dental tissue is presented. The original paper presents the characterization of SHEDs according to the International Society of Cellular Therapy (n =5). To evaluate the metabolic • activity, the WST-8 assay was performed after 1, 3, 5, 7 and 14 days of cultivation under a hypoxic or normoxic environment. The Ki67 antibody was used to examine the proliferation by flow cytometry. Analysis of apoptosis was measured using Annexin V I Propidium iodide after 1, 4 and 7 days in the hypoxia or normoxia groups. The expression of pluripotency related genes (Oct4, Sox2 and Nanog) was measured by quantitative PCR after 24 hours and 7 days. The statistical comparison between the groups was performed with Student t test. No differences were observed in metabolic activity, apoptosis and proliferation of SHEDs cultivated in norrnoxic or hypoxic (p> 0.05). The WST -8 showed exponential growth for all the samples throughout the . . duration of the experiment. The major fraction of proliferative cells was observed on the fourth day in both groups, while a small fraction o f mito ti c cells was found on days 1 and 7. The expression of Oct4, Sox2 and Nanog was significantly higher in the hypoxia group (p < 0.01) in 24 hours and in 7 days. These findings point to the increase in pluripotency markers, related to the differentiation capacity, as the main advantage of SHED cultivation under a hypoxic environment.