Exposição embrionária ao etanol induz alterações comportamentais e neuroquímicas em Zebrafish adulto

Abstract

As Desordens do Espectro Alcoólico Fetal (Fetal alcohol spectrum disorders – FASD) são um conjunto de desordens neuro-desenvolvimentais, que incluem alterações morfológicas, neuroquímicas e comportamentais. Durante a última década, o zebrafish têm se tornado um excelente modelo para analisar os efeitos, tanto a curto quanto a longo prazos, das formas severas e brandas desta desordem, incluindo possíveis alterações na morfologia cerebral, déficits comportamentais e modificações nos sistemas de neurotransmissão. O objetivo desta tese foi analisar as possíveis alterações comportamentais e neuroquímicas em zebrafish adultos expostos a diferentes concentrações de etanol durante a fase inicial do desenvolvimento. Os embriões (24 horas pós-fertilização) foram expostos, durante duas horas, a diferentes concentrações de etanol (0.1%, 0.25%, 0.5%, e 1%), mimetizando formas brandas da Síndrome alcoólica fetal. Na idade adulta, os animais foram submetidos a análises comportamentais, neuroquímicas e morfológicas. Inicialmente, os animais foram submetidos aos testes comportamentais de exploração ao Tanque novo (Novel tank test) e preferência social. Observamos que a exposição ao etanol em fases iniciais do desenvolvimento induz, de forma concentraçãodependente, uma redução no tempo gasto na zona coespecífica, próxima ao cardume, e alterações significativas na tarefa de Tanque novo (ex.: aumento do tempo no fundo do aparato), sugerindo elevada ansiedade, enquanto, o tratamento com buspirona mostrou que a redução de ansiedade está relacionada com redução no comportamento de cardume. Após, os animais foram mortos e seus cérebros removidos para análises neuroquímicas e histológicas. Os seguintes parâmetros foram avaliados: binding e captação de glutamato, imunoconteúdo de VGLUT2, atividade das enzimas glutamina-sintetase e Na+/K+ ATPase e respirometria de alta-resolução. Outro grupo de animais foi utilizado para preparação de lâminas histológicas e subsequente avaliação da neurodegeneração na região do tálamo. Quanto aos parâmetros neuroquímicos do sistema glutamatérgico, observamos redução na captação de glutamato dependente de Na+ no cérebro de zebrafish adulto, a qual pode ser modulada pelo tratamento com ceftriaxona, através do aumento da expressão do transportador EAAT2. Os grupos de maior concentração de etanol, 0,5 e 1%, apresentaram redução na ligação de glutamato em frações enriquecidas de membrana e diminuição na atividade da enzima Na+/K+ ATPase. Além disso, observamos redução da atividade da enzima glutamina-sintetase no grupo EtOH 1%. A exposição embrionária ao etanol não alterou o imunoconteúdo do transportador vesicular de glutamato VGLUT2, o metabolismo energético mitocondrial, e nem o número de neurônios do tálamo dos animais adultos. Nossos resultados confirmam que a exposição a diferentes concentrações de etanol durante o desenvolvimento leva a alterações comportamentais que persistem até a idade adulta, tais como ansiedade e diminuição da interação social. Quanto aos parâmetros neuroquímicos, a exposição embrionária ao etanol pode levar a alterações na neurotransmissão glutamatérgica no cérebro de zebrafish adulto, contudo, sem alterações nos núcleos anterior, ventrolateral e ventromedial do tálamo destes animais. Concluímos que mesmo a exposição embrionária a baixas concentrações de etanol é capaz de induzir alterações comportamentais e neuroquímicas, que persistem ao longo da vida do indivíduo.

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a wide range of ethanol-induced developmental disabilities, including craniofacial dysmorphology, neurochemical and behavioral impairments. Zebrafish has become a popular animal model to evaluate the long-lasting effects of severe and milder forms of Fetal alcohol spectrum disorders, including alterations of neurotransmission, behavior impairments and cerebral structure. Avoidance of social interaction typical of Fetal alcohol spectrum disorders may be the result of increased anxiety and could be correlated with neurochemical alterations. Glutamate is one of the most affected neurotransmitter systems in ethanol-induced developmental disabilities, including decrease of glutamate uptake on adult animal brain. This thesis proposes to assess the behavioral and neurochemical alterations in adult zebrafish after exposure to different concentrations of ethanol in the initial phase of its development. Zebrafish larvae (24 hours post-fertilization) were exposed to ethanol (0.1%, 0.25%, 0.5%, and 1%) for 2 hours, to mimic the most prevalent milder Fetal alcohol syndrome cases. In the adult age (4 - 6 months), the animals were tested in different behavioral tasks: exploration of novel apparatus tank and social interaction. After the behavior analysis, the animals were euthanized and their brains were removed. The following parameters were measured: glutamate uptake, glutamate binding, VGLUT2 immunocontent, glutamine synthetase activity, Na+/K+ ATPase activity, and high-resolution respirometry. The brains also were processed to histological sections to analyze possible modifications in the number of neurons at the thalamus. We observed an ethanol concentration dependent reduction of time spend in the conspecific zone, near the shoaling, compared to control and significant changes in the novel tank (e.g. increased bottom dwell time, increased distance to top) suggesting elevated anxiety to control, but we also found, using an anxiolytic drug buspirone, that reduction of anxiety is associated with reduced shoaling. Embryonic ethanol exposure reduced Na+-dependent glutamate uptake in the zebrafish brain. This reduction was positively modulated by ceftriaxone treatment, a beta-lactam antibiotic that promotes the expression of the glutamate transporter EAAT2. Moreover, the 0.5 % and 1% ethanol groups demonstrated reduced glutamate binding to brain membranes and decreased Na+/K+ ATPase activity in adulthood. In addition, ethanol reduced glutamine synthetase activity in the 1% EtOH group. Embryonic ethanol exposure did not alter the immunocontent of the glutamate vesicular transporter VGLUT2, the mitochondrial energetic metabolism of the brain and the number of neurons in the thalamus. Our results confirm that prior exposure to different concentrations of ethanol during the development leads to behavioral changes in adulthood, such as anxiety and decreased social interaction. Embryonic ethanol exposure may cause significant alterations in glutamatergic neurotransmission in the adult zebrafish brain, without alterations on the zebrafish anterior, ventrolateral and ventromedial thalamic nuclei. In conclusion, embryonic exposure even at low ethanol concentrations is able to impairs behavior profile and crucial aspects of brain health such as the glutamate metabolism in a long-lasting form.