Análises comparativas entre vitrificação em recipiente metálico e congelamen-to lento para criopreservação de tecido ovariano humano : aspectos morfológi-cos e resposta ao choque térmico

Abstract

Introdução: A preservação da fertilidade feminina pré-tratamento oncológico visan-do possibilitar gestações futuras e a preservação da função ovariana é uma reali-dade. A criopreservação de embriões ou de oócitos é uma opção, mas posterga o tratamento oncológico por requerer estimulação ovariana e coleta de oócitos. Então, uma alternativa é a criopreservação de tecido ovariano por congelamento lento ou por vitrificação. A vitrificação apresenta como vantagens em relação ao congelamen-to lento a rapidez e não necessitar equipamento específico. Nosso grupo desenvol-veu uma cápsula metálica para vitrificação que permite um resfriamento rápido do material biológico e elimina a possibilidade de contato do tecido nela armazenado com o nitrogênio liquido (NL2) (Bos-Mikich et al., 2012; Aquino et al., 2014), uma po-tencial fonte de contaminação biológica. No entanto, independentemente da técnica de criopreservação utilizada, ela pode ser nociva aos tecidos e suas células, podendo afetar o seu funcionamento normal após o retorno á temperatura fisiológi-ca. Uma das estratégias desenvolvidas pelas células, ao longo da evolução, para se protegerem dos efeitos deletérios de diversos tipos de estresse não letais (como es-tresse térmico, químico, metabólico, entre outros) é o aumento da expressão das proteínas de choque térmico, particularmente, as de 70 kDa (HSP70). As HSP70 são utilizadas como marcadores universais da resposta celular ao estresse e já foram avaliadas em tecido ovariano de mamíferos pós criopreservação. Nosso laboratório desenvolveu uma técnica que possibilita avaliar a resposta ao choque térmico em diferentes células e tecidos (HSR, capacidade de aumentar a expressão de HSP70 frente ao desafio térmico) (Krause et al., 2015a). Esta técnica foi empregada no pre-sente trabalho, para testar como o tecido criopreservado responde a condições ad-versas após seu retorno a temperatura fisiológica. Objetivo: Comparar a efetividade da criopreservação de tecido ovariano humano pela técnica de vitrificação em recipi-ente metálico com a técnica de congelamento lento avaliando aspectos morfológicos e a resposta fisiológica ao choque térmico em termos de expressão das HSP70. Métodos: Laboratório de Fisiologia Celular e Laboratório de Embriologia e Histologia Comparadas do Instituto de Ciências Básicas da Saúde (ICBS) da UFRGS. Estudo experimental prospectivo pareado controlado com doze pacientes submetidas a videolaparoscopia ginecológica no Hospital Fêmina, no período de março a dezem-bro de 2018. Foi realizada biópsia superficial de tecido cortical ovariano e secciona-da em vários fragmentos menores medindo 2mm x 3mm x 1-2mm. Os fragmentos de cada paciente foram alocados em 3 condições: i) tecido ovariano fresco (tecido ime-diatamente avaliado), ii) tecido ovariano submetido a congelamento lento e iii) tecido ovariano submetido a vitrificação. Após reaquecimento ou descongelamento, todos os grupos foram avaliados morfologicamente. A avaliação fisiológica pela resposta ao choque térmico (HSR), foi realizada através da quantificação do imunoconteúdo de HSP70 a 37ºC e após elevação da temperatura para 42ºC por 2h. A quantificação de HSP70 foi realizada após 8 horas do choque térmico, por western blotting. O ta-manho da amostra foi calculado utilizando-se o programa WINPEPI, com poder de 80% e nível de significância de 5% e considerando a diferença esperada entre as proporções de 93% de folículos primordiais para vitrificação e 68% para conge-lamento lento. Resultados: O tecido ovariano fresco apresentou maior quantidade de folículos totais intactos quando comparado ao total de folículos nos grupos de tecido ovariano submetidos a congelamento lento e vitrificação (p=0,007). Quando comparadas as frequências de folículos intactos entre os grupos, houve diferença apenas para os folículos primordiais (p<0,001). A diferença foi encontrada entre o grupo fresco e os grupos de congelamento lento e vitrificação, que apresentaram menor porcentagem de folículos primordiais intactos, embora com números absolu-tos maiores no grupo de vitrificação. A HSR, avaliada pela expressão de HSP70, foi mais elevada no tecido ovariano fresco (p=0,001) e negativa após criopreservação. Não houve diferença da mediana de HSP70 entre as temperaturas nos grupos de congelamento lento e vitrificação (p=0,937). Conclusão: A criopreservação de te-cido ovariano, induzida por congelamento lento ou vitrificação, resulta, pelo menos nos tempos avaliados, na incapacidade das células/tecido ovariano de responder ao estresse térmico, embora tenha ocorrido uma melhor resposta fisiológica para o congelamento lento. A avaliação morfológica constatou que as duas técnicas apresentam comprometimento similar após a criopreservação, com vantagem para a vitrificação quando avaliada a quantidade de folículos primordiais intactos.

Introduction: The preservation of female fertility prior to oncological treatment has been receiving more attention from health professionals aiming not only to guarantee the possibility of procreation but also to restore ovarian physiological functions. Cur-rent alternatives are the cryopreservation of embryos or oocytes, but they may delay the oncological treatment. The alternative may be cryopreservation of ovarian tissue by slow freezing or by vitrification, that is a more attractive possibility in relation to the slow freezing because it is faster and does not require specific equipment. Our group developed a metal capsule for vitrification which allows extremely rapid cooling of the biological material and eliminates the possibility of contact of the stored tissue with liquid nitrogen (LN2) (Bos-Mikich et al., 2012; Aquino et al., 2014), a potential source of biological contamination. Regardless of the cryopreservation technique used, it imposes a potentially harmful challenge on tissues and their cells, which may affect their normal functioning after returning to physiological temperature, compromising their subsequent use. One of the strategies developed by cells, throughout evolution, to protect themselves from the harmful effects of several types of non-lethal stress (such as thermal, chemical, metabolic stress, among others) is the increase in the expression of heat shock proteins, particularly, those of 70 kDa (HSP70). Heat shock proteins (HSP) are used as universal markers of the physiological response to stress and have already been evaluated in mammalian ovarian tissue after cryopreserva-tion. Our laboratory has developed a technique that makes it possible to evaluate the response to thermal shock in different cells and tissues (HSR, ability to increase the expression of HSP70 in the face of the thermal challenge) (Krause et al., 2015a). This technique was used in the present work, to test how the cryopreserved tissue responds to adverse conditions after its return to physiological temperature. Objective: To compare the effectiveness of cryopreservation of human ovarian tissue us-ing the metal capsule vitrification technique with the slow freezing technique, evalu-ating morphological aspects and the physiological response to thermal shock in terms of HSP70 expression. Methods: Laboratory of Cellular Physiology and Laboratory of Embriology and His-tology of the Institute of Basic Health Sciences (ICBS), UFRGS. Prospective con-trolled experimental study with twelve patients submitted to gynecological videolapa-roscopy at the Femina Hospital, from March to December, 2018. A superficial biopsy of ovarian cortical tissue was performed and sectioned into several smaller fragments measuring 1mm x 3mm x 1mm. The fragments of each patient were allocated in 3 conditions: i) fresh ovarian tissue, ii) ovarian tissue submitted to slow freezing and iii) ovarian tissue submitted to vitrification. All groups were evaluated morphologically and histologically. The physiological evaluation by the response to thermal shock (HSR), was carried out by quantifying the HSP70 immunocontent at 37ºC and after raising the temperature to 42ºC for 2h. HSP70 was quantified after 8 hours, by west-ern blotting. The sample size was calculated using the WINPEPI program, with a power of 80% and significance level of 5% and considering the expected difference between the proportions of primordial follicles for vitrification and 68% for slow freez-ing. Results: Fresh ovarian tissue showed a higher amount of good total follicles compared to total follicles in the ovarian tissue groups submitted to slow freezing and vitrification (p=0.007). When comparing the frequencies of intact follicles between groups, there was a difference only for primordial follicles (p<0.001). The difference was found between the fresh group and the slow freezing and vitrification groups, which had lower percentage of intact primordial follicles, with higher absolute num-bers in the vitrification group. The HSR, assessed by the expression of HSP70, was higher in fresh ovarian tissue (p=0.001) and negative after cryopreservation. When comparing the two techniques, a higher HSP70 content was found after slow freezing than after vitrification, which may indicate, despite the low number of follicles, a better cytoprotection in the group submitted to slow freezing. There was no difference in the median of HSP70 between temperatures in the slow freezing and vitrification groups (p=0.937). Conclusion: Ovarian tissue cryopreservation, induced by slow freezing or vitrification, results, at least in the evaluated times, in the inability of ovarian cells / tissue to respond to thermal stress, although with better cytoprotection for slow freez-ing. The morphological evaluation found that both techniques present similar impair-ment due to cryopreservation, with advantage for vitrification when the amount of intact primordial follicles was evaluated.