Strategies for gene editing using the crispr system for the generation of genetically engineered livestock

Abstract

The better understanding of molecular biology procedures has enabled the improvement of gene editing strategies, such as the CRISPR system, making it possible to modulate genes at specific sites in the genome, including changes in epigenetic marks, subjects that were addressed in Chapter I. Therefore, the aims of this thesis were to compare different strategies using the CRISPR system (a) to promote partial cellular reprogramming in pig fibroblast cells using the CRISPR activation system (CRISPRa); and (b) to evaluate embryo survival and viability after zygote microinjection with CRISPR/Cas9 system and DNA oligonucleotide templates to promote homologous recombination into safe harbor loci (SHL) in bovine embryos produced by in vitro fertilization (IVF) procedures. In Chapter II, the efficiencies of two nucleases fused to activation domains (dCas9-VPR and dCpf1/Cas12a-VPR) were compared in enabling the transient upregulation of reprogramming target genes (Oct4, Myc, Klf4, Sox2 and Lin28a), and for the ability to alter transcription of downstream genes related to reprogramming of porcine somatic cells at advanced passages. The dCas9-VPR more effectively upregulated single genes than dCpf1-VPR, also using lower number of gRNAs per gene, with highest expression levels for Myc and Lin28a genes. On the other hand, dCas9-VPR failed to upregulate multiple genes concomitantly, although downstream effects were detected in the expression of p53 and Dkc1 genes. The CRISPRa system promoted partial reprogramming in pig somatic cells in vitro, although at lesser extent than expected. In Chapter III, the in vitro survival and developmental outcome of IVF bovine embryos were assessed after cytoplasmic microinjection (MI) of CRISPR/Cas9 system and DNA templates at the 1-cell stage embryo, targeting the SHL H11 and Rosa26. Bovine COCs were in vitro matured for 20 h and fertilized for either 8 h (treatment groups) or 18 h (Intact Group). Groups of presumptive zygotes were partially denuded 8 h post-fertilization (hpf), and then segregated into treatment groups: Semi-denuded (Semi), non-MI control; group MI with CRISPR/Cas9; and SHL groups, MI with CRISPR/Cas9, gRNA for each SHL, and one of two doses of repair oligonucleotide templates (5 ng/μL or 20 ng/μL). Embryos were in vitro cultured up to the blastocyst stage, evaluating post-MI survival (D1), cleavage (D2) and blastocyst (D7) rates. Survival was not affected by the injection of either the CRISPR/Cas9 system, the doses, or the target loci, although the partial cumulus cells removal at 8 hpf, or the microinjection of donor oligonucleotides and the CRISPR/Cas9 system reduced development to the blastocyst stage (lower than 20% in most groups) in comparison to controls (above 20%), irrespective of the injected dose or the targeted locus. The microinjection with repair templates and CRISPR/Cas9 system was feasible for homologous recombination experiments in bovine preimplantation IVF embryos, despite the reduction in embryo development. In conclusion, the strategies using CRISPR approaches to assist in gene editing pig cells in culture or early bovine IVF embryos were feasible and rather efficient. On the other hand, the performance of other experiments will be necessary to evaluate the feasibility of using reprogrammed pig cells for cloning, and the efficiency by genomic analyses of the strategies used for homologous recombination in bovine embryos.

O melhor entendimento dos procedimentos de biologia molecular tem possibilitado o aprimoramento de estratégias de edição gênica, como o sistema CRISPR, possibilitando a modulação de genes em locais específicos do genoma, incluindo modificações de marcações epigenéticas, temas que foram abordados no Capítulo I. Os objetivos desta tese foram comparar diferentes estratégias utilizando o sistema CRISPR (a) para promover a reprogramação celular parcial de fibroblastos suínos utilizando o sistema de ativação com CRISPR (CRISPRa); e (b) avaliar a sobrevivência e a viabilidade de embriões bovinos após a microinjeção de zigotos com o sistema CRISPR/Cas9 e modelos de reparo de DNA para promover recombinação homóloga em safe harbor loci (SHL) em embriões bovinos produzidos por fecundação in vitro (FIV). No Capítulo II, as eficiências de duas nucleases de fusão com domínios de ativação (dCas9-VPR e dCpf1/Cas12a-VPR) foram comparadas para permitir a ativação da expressão transitória de genes alvo de reprogramação (Oct4, Myc, Klf4, Sox2 e Lin28a), e para alterar a transcrição de genes relacionados à senescência celular em células de suínos em passagens avançadas. A dCas9-VPR regulou positivamente genes únicos de forma mais eficaz do que a dCpf1-VPR, também usando menor número de gRNAs por gene, com maior nível de expressão para os genes Myc e Lin28a. Por outro lado, a dCas9-VPR não foi efetiva na regulação de múltiplos genes concomitantemente, embora tenham sido observados efeitos possivelmente relacionados aos genes-alvo, como a expressão dos genes p53 e Dkc1. O sistema CRISPRa promoveu a reprogramação in vitro parcial de células suínas em cultivo, apesar de em um nível menor do que o esperado. No Capítulo III, a sobrevivência in vitro e o desenvolvimento de embriões bovinos de FIV foram avaliados após a microinjeção citoplasmática (MI) do sistema CRISPR/Cas9 e de oligonucleotídeos de reparo de DNA em embriões no estádio de 1-célula, tendo como alvo os SHL H11 e Rosa26. Após a MIV por 20 h, CCOs bovinos foram fecundados in vitro por 8 h (grupos tratamento) ou por 18 h (grupo intacto). Grupos de zigotos foram parcialmente desnudados 8 h pós-fecundação (hpf) e, em seguida, segregados em grupos tratamento: Semi-desnudo (Semi), controle sem MI; grupo MI com CRISPR/Cas9; e grupos SHL, MI com CRISPR/Cas9, gRNA para cada SHL e uma das duas doses de oligonucleotídeos de reparo de DNA (5 ng/μL ou 20 ng/μL). Os embriões foram cultivados in vitro até o estádio de blastocisto, avaliando-se as taxas de sobrevivência pós-MI (D1), clivagem (D2) e de blastocisto (D7). A sobrevivência não foi afetada pela injeção do sistema CRISPR/Cas9, nem pelas doses ou os loci- alvo, embora a remoção parcial das células do cumulus com 8 hpf, ou a microinjeção de oligonucleotídeos de reparo de DNA com o sistema CRISPR/Cas9 reduziram o desenvolvimento a blastocisto (inferior a 20% na maioria dos grupos) em comparação com os controles (acima de 20%), independentemente da dose injetada ou do locus- alvo. A microinjeção com oligonucleotídeos de reparo de DNA com o sistema CRISPR/Cas9 se demonstrou viável para experimentos de recombinação homóloga em embriões bovinos de FIV, apesar da redução no desenvolvimento embrionário. Em conclusão, as estratégias utilizando o sistema CRISPR para auxiliar na edição gênica em cultivo de células somáticas suínas ou em embriões bovinos de FIV foram viáveis e relativamente eficientes. Por outro lado, a realização de outros experimentos será necessária para avaliar a viabilidade do uso de células de suínos reprogramadas para a clonagem, e a eficiência por análise genômica dos resultados das estratégias utilizadas para a recombinação homóloga em embriões bovinos.