Produção e caracterização de uma célula com múltiplas fluorescências

Abstract

A resistência de células tumorais à terapia consiste na principal causa de falha terapêutica no tratamento de câncer e está diretamente relacionada à heterogeneidade tumoral. Estudos populacionais falham em demonstrar as particularidades de cada célula em uma massa tumoral e, com isso, técnicas de análises de células únicas emergiram para o auxílio da compreensão da biologia tumoral. Entretanto, essas análises são ainda muito incipientes e dependem de pessoas altamente capacitadas e equipamentos e reagente de alto valor monetário e baixa disponibilidade nos centros de pesquisa. Tendo isso em vista, foi construída uma célula com marcação genômica de fluorescência de processos celulares importantes (quebra de fita duplas no DNA, apoptose e autofagia) para o estudo de células individuais vivas. Estas marcações foram, respectivamente: 53BP1 (vermelho), IMS simulando DIABLO (vermelho) e LC3B (ciano). Também foi desenvolvida uma ferramenta personalizada para análise automatizada de foci de dano ao DNA. Apesar de algumas alterações nas marcações celulares serem necessárias, foi possível mostrar que o sistema de tripla marcação é eficiente para o estudo de células únicas e não interfere o funcionamento celular de maneira a atrapalhar análises posteriores.

Therapy resistance is one of the main causes of therapeutic failures in cancer treatment and it is directly related to tumoral heterogeneity. Populational studies fail in demonstrate the particularities of single cells in a tumor, and so single cell analysis techniques emerged to assist in the tumoral biology comprehension. However, these analyses are still incipient and demand highly skilled persons and high cost of reagent and equipment, not always available in all research centers. Thereby a cell transduced with three sensors for important processes in cancer biology (DNA damage, autophagy and apoptosis) was constructed for single-cell studies. We also developed a personalized tool for automated analysis of DNA damage foci. Despite the need of some changes in the chosen vectors, it was possible to show that a triple staining system is efficient for single-cell studies and it does not interfere in the cell function.