Ferramentas alternativas para identificação microbiana, determinação de suscetibilidade e detecção de mecanismos de resistência

Abstract

O papel do laboratório de microbiologia clínica é realizar a identificação do microrganismo, determinar o perfil de suscetibilidade e, quando pertinente, os mecanismos de resistência, o mais breve possível. A microbiologia difere significativamente das demais áreas das análises clínicas, pois os processos são dependentes de crescimento microbiano, resultando em tempo maior para liberação de resultados. Tendo em vista que a replicação microbiana naturalmente demanda tempo, ferramentas para agilização de processos de caracterização microbiana devem ser priorizadas. O teste de referência para detecção de resistência à polimixina B, por exemplo, requer tempo de incubação prolongado (aproximadamente 24h). Tendo em vista a demora para obtenção do perfil de suscetibilidade através de métodos fenotípicos convencionais, se torna ainda mais importante a pesquisa por abordagens que forneçam resultados confiáveis em tempos de incubação menores. Por outro lado, as metodologias que utilizam as técnicas baseadas em espectrometria de massas (técnica de MALDI-TOF) e em amplificação de material genético (técnica de qPCR HRM) são consideradas referência para a identificação microbiana e de enzimas que degradam antiobióticos carbapenêmicos (carbapenemases), respectivamente. Considerando a atual situação sanitária decorrente do crescente aumento no número de casos de COVID-19, mesmo mais de dois anos após o início da pandemia, ainda existe a necessidade de ampliar a testagem através de metodologias que forneçam resultados confiáveis. A principal metodologia para detecção de SARS-CoV-2 é o RT-qPCR. As técnicas acima mencionadas, requerem, no entanto, equipamentos que apresentam elevado investimento inicial, o que os torna restritos a laboratórios de grande porte, com grande demanda de exames. Então um desafio importante é tornar possível que as vantagens dessas tecnologias possam ser utilizadas por laboratórios de pequeno porte. O uso de papel filtro para o transporte de amostras microbianas/biológicas pode facilitar significativamente o envio de microrganismos entre laboratórios. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o papel filtro como meio de transporte de microrganismos/espécimes respiratórios inativados para identificação por MALDI-TOF MS, detecção de carbapenemases por qPCR HRM e SARS-Cov-2 por RT-qPCR. Assim como, propor e avaliar métodos rápidos para determinação de suscetibilidade à polimixina B. Para avaliar a capacidade do papel filtro como meio de transporte de microrganismos inativados para identificação por MALDI-TOF MS, foram avaliados 363 isolados da Ordem Enterobacterales, Bacilos Gram-negativos não-fermentadores, Haemophilus influenzae, micobactérias não tuberculosas e leveduras. Para detecção de carbapenemases por qPCR HRM foram avaliados 88 isolados da Ordem Enterobacterales. Para a detecção de SARS-CoV-2 por RT-qPCR foram avaliados 40 espécimes respiratórios de oro/nasofaringe transportados em papel de filtro. Os isolados/espécimes respiratórios foram inativados, impregnados em discos de papel filtro estéril, as proteínas (para identificação em MALDI-TOF MS) e o material genético (para as técnicas de qPCR HRM e RT-qPCR) foram extraídos. Os resultados após a impregnação em papel filtro foram comparados com os resultados diretamente da colônia/espécime respiratório. Para avaliação da leitura antecipada da microdiluição em caldo para polimixina B comparamos a concentração inibitória mínima (CIM) de 192 isolados de Bacilos Gram-negativos (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa) obtida em 8-9h de incubação (leitura antecipada) e em 16-20h de incubação (leitura padronizada) da microdiuição em caldo para polimixina B. Além disso, deselvolvemos um novo teste qualitativo de suscetibilidade à polimixina B através do MALDI-TOF MS (MALDI POLYMYXIN TEST – MPT). Para essa proposta, comparamos os resultados de microdiluição em caldo de polimixina B de 95 isolados de Enterobacterales frente ao MPT. Considerando a correta identificação dos isolados com scores >1.7 em MALDI-TOF MS, 354/363 isolados apresentaram a mesma identificação diretamente da colônia e após o processo de impregnação em papel filtro. O método de transporte de microrganismo inativado apresentou alta sensibilidade (97,6%) e especificidade (100%) quando comparados a identificação realizada diretamente da colônia. O papel filtro também foi avaliado quanto a capacidade de transportar isolados bacterianos inativados para detecção de carbapenemases por qPCR HRM e 87/88 isolados apresentaram o mesmo resultado (presença ou ausência de carbapenemases). Apenas um isolado caracterizado previamente como blaNDM não apresentou o resultado esperado após a impregnação em papel filtro. Esse teste apresentou sensibilidade de 98,86% e especificidade de 100%. O papel filtro foi utilizado para o transporte de espécime respiratório para pesquisa de SARS-Cov-2 e apresentou resultados excelentes de concordância (97,2%) com o resultado obtido da extração direta do espécime respiratório. A leitura antecipada da técnica de microdiluição em caldo para polimixina B e o MPT apresentaram 97,9% e 95,8% de concordância categórica com o método de referência, respectivamente. O papel filtro pode ser utilizado como meio de transporte alternativo para os microrganismos e metodologias supracitadas. Tanto a leitura antecipada da microdiluição em caldo para polimixina B quanto o MPT apresentaram alta concordância com a microdiluição em caldo; portanto, essas metodologias poderiam ser empregadas na rotina do laboratório de microbiologia e possibilitariam a liberação do resultado de suscetibilidade à polimixina B no mesmo dia em que a bactéria é identificada.

The role of the microbiology laboratory is to perform microorganism identification, to determine susceptibility profile and, when relevant, resistance mechanisms, as soon as possible. Microbiology differs from other areas of clinical analysis, as the processes are dependent of microbial growth, resulting in longer times to release results. Since microbial replication naturally takes time, approaches to optimize microbial characterization procedures must be prioritized. The reference method to detect polymyxin B resistance requires prolonged incubation time (approximately 24h). Due to delays in the susceptibility tests results using conventional phenotypic methods, research on approaches that could provide reliable results in shorter incubation times are important. Methodologies based on mass spectrometry (MALDI-TOF) and amplification of genetic material (qPCR HRM) are reference for the microbial identification and detection of carbapenemases, respectively. Considering the current health scenery due to the increase of COVID-19 cases, there is still a need to expand testing using reliable methodologies. The RT-qPCR is the main methodology to SARS-CoV-2 detection. All mentioned techniques require equipment with high investment, being only accessible to laboratories with high demand of exams. An important challenge is to enable the advantages of these technologies to be used by small laboratories. The use of filter paper to transport microbial/biological samples can be an advantage to send microorganisms between laboratories. This study aimed to evaluate filter paper as a means of transporting inactivated microorganisms/respiratory specimens to be identified by MALDI-TOF MS and for carbapenemases and SARS-CoV-2 detection by qPCR HRM and RT-qPCR, respectively. Moreover, to propose and evaluate rapid methods to determine polymyxin B susceptibility. For evaluate filter paper as a means of transporting inactivated microorganisms to identification in MALDI-TOF MS, 363 isolates of Enterobacterales, Gram-negative non-fermentative, Haemophilus influenzae, nontuberculous mycobacteria and yeasts were evaluated. For the filter paper evaluation for carbapenemases detection by qPCR HRM, 88 isolates of Enterobacterales were evaluated. For the filter paper evaluation for SARS-CoV-2 detection by RT-qPCR, 40 oro/nasopharyngeal respiratory specimens transported in filter paper were evaluated. Isolates/respiratory specimens were inactivated, impregnated in sterile filter paper disks, and proteins (for MALDI-TOF MS identification) and genetical material (for qPCR HRM and RT-qPCR methodologies) were extracted. Results after impregnation were compared to results obtained directly from colony/respiratory specimens. For the early reading of broth microdilution (BMD) for polymyxin B, minimal inhibitory concentration (MIC) of 192 isolates (Enterobacterales, A. baumannii e P. aeruginosa) were compared in 8-9h (early reading) and 16-20h (standard reading) of incubation of polymyxin B BMD. In addition, we described a new qualitative polymyxin B susceptibility test using MALDI-TOF MS (MALDI POLYMYXIN TEST – MPT). For this purpose, we compared MPT results of 95 Enterobacterales isolates with polymyxin B BMD. Considering the correct isolate identification with scores > 1.7 in MALDI-TOF MS, 354/363 isolates presented the same identification directly from the colony and after impregnation in filter paper. The method of transporting inactivated microorganism presented high sensitivity (97.6%) and specificity (100%) when compared to the identification performed directly from the colony. For the carbapenemases detection by qPCR HRM after filter paper impregnation, 87/88 isolates presented the same result (presence or absence of carbapenemases), resulting in 98.86% of sensitivity and 100% of specificity. Only one isolate previously characterized as blaNDM did not present the expected result. The filter paper evaluation for SARS-CoV-2 detection by RT-qPCR presented excellent results of concordance (97.2%) compared with the direct extraction of the respiratory specimens. The early reading of polymyxin B BMD and MPT presented 97.9% and 95.8% of categorical agreement with the reference method, respectively. The filter paper can be used as an alternative means of transporting of microorganisms in order to carry out methodologies above-mentioned. Both early reading of polymyxin B and MPT presented high concordance with BMD; therefore, these methodologies may be employed in routine of microbiological laboratory and would allow to release polymyxin B results in the same day that bacteria is identified.