Segregação de células somáticas seminais de bovinos e ovinos frente a diferentes diluentes para resfriamento e congelamento de sêmen

Abstract

A ocorrência de células somáticas no sêmen possibilita seu uso para a produção in vitro (PIV) de embriões pela clonagem animal por transferência nuclear de célula somática (TNCS). Visando o melhor aproveitamento desta fonte de material biológico, Nel-Themaat e colaboradores propuseram em 2008 um protocolo com o gradiente de Percoll® que possibilita o isolamento de células somáticas seminais (CSS) e espermatozoides (STPZ) de uma mesma dose de sêmen para uso na clonagem animal e na fecundação in vitro (FIV), respectivamente. Porém, ao aplicarmos tal protocolo para o sêmen bovino e ovino, observamos diferentes resultados de segregação celular, dependendo das características da amostra. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos de diferentes diluentes para refrigeração e congelamento de sêmen bovino e ovino frente ao processo de segregação de CSS e SPTZ viáveis utilizando um gradiente de Percoll®. Para tanto, foi utilizado o sêmen de três carneiros cruzas Texel e de quatro touros Brangus, todos machos adultos e férteis. O ejaculado de cada macho foi dividido em oito grupos, sendo uma amostra de sêmen fresco e sete amostras diluídas em cinco diluentes comuns para ambas as espécies (Tris-Gema, TG; Citrato-Gema, CG; Tris-Gema-Glicerol, TGG; Citrato-Gema-Glicerol, CGG; e um diluente comercial), e em dois diluentes específicos para cada espécie (Leite Desnatado, LD e Leite Desnatado-Glicerolado, LDG, para ovinos; ou Lactose-Gema, LG e Lactose-Gema-Glicerol, LDG, para bovinos), para a refrigeração por 24 h (diluentes sem glicerol TG, CG, LD) ou para a congelação (diluentes com glicerol TGG, CGG, LDG, comercial). A avaliação do perfil de segregação de CSS foi realizada após a coleta do sêmen fresco (-3 h), quando o sêmen diluído atingiu o equilíbrio a 5ºC (0 h), e 24 h após o equilíbrio a 5ºC (sêmen refrigerado), ou após o descongelamento (sêmen congelado). Cada uma das oito amostras distintas de cada ejaculado, nos diferentes tempos, foi submetida à centrifugação para a segregação celular em gradiente de 20/50/90% de Percoll®. Cada amostra foi então coletada em quatro frações do gradiente, sendo a FTI a fração superficial do gradiente de 20% de Percoll®; a FTII a fração entre os gradientes de 20% e 50% de Percoll®; a FTIII a fração remanescente do gradiente de 50% de Percoll®; e a FTIV a fração contendo o pellet formado no gradiente de 90% de Percoll®. Cada fração foi analisada quanto à presença de CSS, espermatozoides e debris celulares, com os dados analisados por ANOVA e Tukey, e pelos testes de Kruskal-Wallis, X2 e correlação simples de Pearson (P<0,05). Nos ovinos e bovinos, não houve diferença no número total de CSS obtidas entre os diluentes, em cada tempo de análise (0 h e 24 h), mas houve diferença entre diluentes quanto à segregação de acordo com as frações de Percoll®, indicando uma migração celular distinta entre os diluentes, para cada espécie, sendo em geral semelhantes entre os tempos, para o mesmo diluente. Em ovinos, o diluente à base de leite desnatado, quando sem glicerol, rendeu um elevado número e proporção de CSS na FTI (LG, 78,1%), enquanto que a adição de glicerol concentrou as CSS na FTII (LDG, 70,5%). Já o sêmen fresco e os diluentes com gema de ovo e sem glicerol apresentaram um maior número e proporção de CSS na FTIII (Fresco, 61,9%; CG, 68,1%; TG, 68,3%). A adição de glicerol ao citrato-gema (CGG) concentrou as CSS na FTII (62,5%). Por fim, os diluentes TGG e o comercial segregaram as CSS na FTIV no t=0 h (64,6% e 66,6%, respectivamente) e na FTIII no t=24 h (70,2% e 50,7%, respectivamente). Em bovinos, o sêmen fresco e o diluente CG concentraram as CSS na FTI (49,1 e 57,5%), enquanto os diluentes TG e LG concentraram as CSS na FTIII (TG, 60,7%) e FTIV (LG, 68,0%). A adição de glicerol alterou o perfil de migração do TGG para a fração FTIV (52,1%) e do LDG para a FTIII (63,9%). O diluente comercial, com glicerol, segregou as CSS em maior proporção nas frações FTIII (31,1%) e FTIV (44,6%). Já o diluente CGG, com glicerol, segregou as CSS na FTIII no t=0 h (46,7%) e na FTIV no t=24 h (42,0%). Em resumo, concluímos que a migração das CSS (número e proporção por frações) se manteve semelhante entre os animais de cada espécie. Porém, a proporção de CSS segregadas dos ejaculados de bovinos e ovinos utilizando o gradiente de Percoll® foi influenciada pela composição do diluente, em especial pelo uso da gema de ovo ou do leite desnatado, e principalmente pela presença ou não de glicerol nos diluentes.

The occurrence of somatic cells in semen enables their use for in vitro production (IPV) of cloned embryos by somatic cell nuclear transfer (SCNT) procedures. To make better use of such source of biological material, in 2008 Nel-Themaat and collaborators proposed a protocol using the Percoll® gradient that allows the isolation of both seminal somatic cells (SSC) and sperm cells (STPZ) from the same dose of semen for use in animal cloning and in vitro fertilization (IVF), respectively. However, when applying this protocol to bovine and ovine semen, we observed different cell segregation patterns, depending on the characteristics of the sample. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of different semen extenders for the refrigeration and freezing of bovine and ovine semen on the process of segregation of viable CSS and SPTZ using a Percoll® gradient. Thus, semen from adult and fertile Texel crossbred rams (n=3) and Brangus bulls (n=4) was used for cell segregation. The ejaculate of each male was divided into eight groups, one of fresh semen and seven samples diluted in five common extenders for both species (Tris-Yolk, TY; Citrate-Yolk, CY; Tris-Yolk-Glycerol, TYG; Citrate-Yolk-Glycerol, CYG; and a commercial extender), and in two specific extenders for each species (Skimmed Milk, SM and Skimmed Milk-Glycerol, LDG, for sheep; or Lactose-Yolk, LY and Lactose-Yolk-Glycerol, LYG, for cattle), either for refrigeration for up to 24 h (without glycerol: TY, CY, SM) or for freezing (with glycerol: TYG, CYG, SMG, commercial). The evaluation of the CSS segregation profile was performed after fresh semen collection (-3 h), when the diluted semen reached equilibrium at 5°C (0 h), and 24 h after equilibrium at 5°C (refrigerated semen), or after thawing (frozen semen). Each of the eight different samples from each ejaculate, at different times, were submitted to centrifugation for cell segregation in a 20/50/90% Percoll® gradient. Each sample was then collected in four gradient fractions, the FTI being the surface fraction of the 20% Percoll® gradient; the FTII as the fraction between the of 20% and 50% Percoll® gradient; the FTIII as the remaining fraction of the 50% Percoll® gradient; and the FTIV as the fraction containing the pellet formed in the 90% Percoll® gradient. Each fraction was analyzed for the presence of SSC, sperm cells and cell debris, with data analyzed by ANOVA and Tukey, and by the Kruskal-Wallis, the X2 and the Pearson's simple correlation tests (P<0.05). In sheep and cattle, no differences were observed in the total number of CSS obtained between the extenders, at each time (0 h and 24 h), but a difference between extenders was observed between Percoll® fractions, indicating a cell migration pattern distinct between extenders, for each species, being generally similar between times, for the same extender. In sheep, the skimmed milk-based extender, when with no glycerol, yielded a high number and proportion of CSS in the FTI (LG, 78.1%), while the addition of glycerol concentrated the CSS in the FTII (SMG, 70.5%). Fresh semen and extenders with egg yolk and without glycerol had a higher number and proportion of CSS in the FTIII (Fresh, 61.9%; CY, 68.1%; TY, 68.3%). The addition of glycerol to citrate-yolk (CYG) concentrated the CSS in the FTII (62.5%). Finally, the TGG and commercial extenders segregated the SSC in the FTIV at t=0 h (64.6% and 66.6%, respectively) and in the FTIII at t=24 h (70.2% and 50.7%, respectively). In cattle, fresh semen and the CY extender concentrated CSS in the FTI (49.1 and 57.5%), while the TG and LG extenders concentrated SSC in the FTIII (TG, 60.7%) and FTIV (LY, 68.0%). The addition of glycerol altered the migration profile of SSC in the TYG to the FTIV (52.1%) and in the SMG to the FTIII (63.9%) Fractions. The commercial extender, with glycerol, segregated the SSC in greater proportion in both the FTIII (31.1%) and FTIV (44.6%) fractions. Finally, the CYG extender, with glycerol, segregated the SSC in the FTIII at t=0 h (46.7%) and in the FTIV at t=24 h (42.0%). In summary, we concluded that the migration of SSC (number and proportion of cells by fraction) remained similar between animals of each species. However, the proportion of SSC segregated from the bovine and ovine semen using the Percoll® gradient was influenced by the composition of the extender, especially by the use of egg yolk or skimmed milk, and mainly by the presence or absence of glycerol in the extenders.