Via colinérgica anti-inflamatória e partículas de membrana de células estromais mesenquimais : novas alternativas terapêuticas para o tratamento das doenças inflamatórias intestinais

Abstract

As doenças inflamatórias intestinais (DII) são doenças crônicas caracterizadas por respostas imunes exacerbadas à microbiota do trato gastrointestinal. A incidência e progressão destas doenças estão associadas a um desequilíbrio entre citocinas pró e anti-inflamatórias, levando a uma resposta imune aumentada na mucosa do trato gastrointestinal (TGI). Os tratamentos atualmente disponíveis visam diminuir a resposta imune no TGI, entretanto, estes podem causar efeitos adversos e não são capazes de promover a remissão sustentada da doença. Assim, alternativas terapêuticas estão sendo estudadas para o tratamento das DII. Em estudos pré-clínicos, o efeito anti-inflamatório da ativação da via colinérgica tem sido reportado. Nesta via, o receptor nicotínico de acetilcolina α-7 está envolvido na inibição de processos inflamatórios, modulando a produção de citocinas e diminuindo a atividade de macrófagos, células dendríticas e linfócitos T. De outro lado, as células estromais mesenquimais (MSCs) são células que possuem um grande potencial terapêutico devido a suas propriedades imunomodulatórias. Entretanto, a administração das MSCs como terapia apresenta alguns riscos, sendo o principal o aprisionamento destas células nos microcapilares pulmonares após transplante. Assim, alternativas que utilizem os benefícios da terapia celular, porém minimizem os riscos desta, estão sendo estudadas. O meio condicionado de MSC (CM) consiste no meio de cultura de MSCs contendo fatores solúveis secretados por estas células, e seu efeito imunomodulador já foi demonstrado tanto in vitro quanto em modelos animais. As partículas de membrana de MSC (MP) são pedaços de membrana contendo proteínas e enzimas, que podem ser geradas a partir da lise de MSCs, cujo efeito imunomodulador já foi observado in vitro. A presente tese inclui um artigo de revisão explorando a via colinérgica nas DII e um manuscrito original, no qual investigamos os efeitos da terapia com MP e com CM no modelo de colite ulcerativa. Entre os dias 0 e 7 do protocolo, os animais receberam 2% de dextran sulfato de sódio (DSS) e, nos dias 2 e 5, receberam os tratamentos com MP, CM, MSC ou veículo (grupo DSS). No dia 8, os animais foram eutanasiados e amostras biológicas foram coletadas. Neste trabalho, observamos que as MP conservam algumas das propriedades terapêuticas de imunomodulação das MSCs íntegras, sendo capazes de reduzir os sinais clínicos da doença, bem como a perda de peso corporal e a inflamação em nível tecidual na análise histológica. As MP, o CM e as MSCs foram eficazes em reduzir a perda de mucinas associada às células caliciformes da mucosa, assim como o número de células apoptóticas no cólon e o número de células CD3+ no tecido, sugerindo que as MP e o CM são alternativas tão eficazes quanto as MSCs para reduzir a infiltração de linfócitos T e a morte de células do cólon neste modelo. Da mesma forma, todos os tratamentos foram capazes de diminuir os níveis de IL6 em comparação ao grupo não tratado. As MP, juntamente com as MSCs, foram eficazes em diminuir os níveis de TNFα em comparação aos animais não tratados. Contudo, apenas o tratamento com MSCs teve efeito nos níveis de IL5, IL12p70 e IFNγ no cólon, sugerindo que poderia ser necessário tanto o contato célula-célula quanto a ação parácrina para a modulação destas citocinas no tecido. Por fim, apenas os tratamentos com MSC e CM foram capazes de reduzir os níveis de IL4, indicando que os fatores solúveis (ausentes no tratamento com as MP) podem ser necessários para modular os níveis desta citocina. Do nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho que avalia o efeito imunomodulador das MP in vivo. Assim, mais estudos são necessários para entender mais profundamente os mecanismos de ação terapêutica das MP em modelos de doenças inflamatórias.

Inflammatory bowel diseases (IBD) are chronic diseases characterized by exacerbated immune responses to the normal gastrointestinal (GI) tract microbiota. The incidence and progression of IBD are associated with an imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokines, leading to an increased immune response in the GI mucosa. Currently available treatments aim to decrease the immune response in the GI tract, however, they are not capable of promoting sustained remission of the disease, besides causing several adverse effects. Thus, therapeutic alternatives are being explored for IBD treatment. In preclinical studies, effects of activating the cholinergic anti-inflammatory pathway (CAIP) have been reported. In this pathway, α-7 nicotinic acetylcholine receptor is involved in the inhibition of inflammatory processes, modulating the production of cytokines and decreasing macrophages, dendritic cells and T lymphocytes activation. Furthermore, mesenchymal stromal cells (MSC) have great therapeutic potential due to their immunomodulatory properties. However, MSC administration as therapy presents some risks, such as the entrapment of these cells in lung microcapillaries after transplantation. Thus, alternatives which use the benefits of cell therapy, but minimize its risks, are being investigated. MSC conditioned medium (CM) consists of MSC culture medium containing soluble factors secreted by these cells, and its immunomodulatory effect has been demonstrated both in vitro and in animal models. MSC membrane particles (MP) are pieces of membrane containing proteins and enzymes, which can be generated from MSC lysis, whose immunomodulatory effect has already been observed in vitro. The present thesis includes a review article exploring the cholinergic anti-inflammatory pathway in IBD and an original manuscript, in which we investigated the effects of MP and CM therapy in a ulcerative colitis model. Between protocol days 0 and 7, mice received 2% sodium dextran sulfate (DSS) and, on days 2 and 5, animals received treatments with MP, CM, MSC or vehicle (DSS group). On day 8, mice were euthanized and biological samples were collected. In the present work, we observed that MP treatment retain most of the immunomodulatory therapeutic properties of living MSC, being able to reduce the clinical signs of the disease, as well as body weight loss and tissue inflammation in the histological analysis. MP, CM and MSCs were effective in reducing mucin loss associated with mucosal goblet cells, as well as the number of apoptotic cells in the colon and the number of CD3+ cells in the tissue, suggesting that MP and CM are effective alternatives to MSCs to reduce T lymphocyte infiltration and colon apoptosis on this model. MP, along with MSCs, were effective in decreasing TNFα levels compared to untreated animals. Similarly, all treatments were able to lower IL6 levels compared to the untreated group. However, only MSC treatment demonstrated an effect on IL5, IL12p70 and IFNγ levels in the colon, suggesting that both cell-cell contact and paracrine factors could be necessary for modulating these cytokines in the colon. Finally, only MSC and CM treatments were able to reduce IL4 levels, indicating that soluble factors (absent in MP treatment) may be necessary to modulate this cytokine. To our knowledge, this is the first work to evaluate MP immunomodulatory effect in vivo. Thus, further studies are necessary to understand more deeply MP mechanisms of therapeutic action in inflammatory disease models.