Espécies reativas de oxigênio derivadas do complexo NADPH-oxidase alteram a migração celular por modular a dinâmica de adesões em células CHO.K1

Abstract

O processo de migração celular envolve a ativação coordenada de moléculas estruturais e de sinalização, como a RhoGTPase Rac1. Sabe-se que a montagem do complexo NADPH oxidase, o qual gera espécies reativas de oxigênio (ERO) na membrana da célula também depende da ativação de Rac1, indicando um possível efeito de ERO durante a migração celular. Nesse trabalho, nós avaliamos os efeitos das ERO no processo de migração celular. Células CHO.K1 foram cultivadas em placas com superfície tratada com fibronectina (2 μg/ml), na presença ou ausência de um antioxidante inespecífico - N-acetil-cisteína (NAC) - ou de inibidores do complexo NADPH oxidase, o di-fenil-iodonio (DPI) ou acetovanilona. Através de vídeos time-lapse, observamos que a depleção de ERO causada por NAC (10 mM) induziu uma diminuição de 60% na velocidade de migração e impactou severamente a direcionalidade da migração das células, o que também foi observado quando utilizado o DPI (10 μM). Posteriormente, analisamos os efeitos da NADPH oxidase em três eventos de migração celular: taxa de protrusão, processo de adesão e vias de sinalização relacionadas com adesão celular. Através de vídeos time-lapse, observamos que o DPI induziu um aumento de ~3 protrusões/célula, as quais foram duas vezes mais rápidas, porém tiveram uma taxa de retração de ~50%, quando comparado ao controle. Com a finalidade de analisar a dinâmica de adesões, células CHO.K1 foram transfectadas com paxilina-GFP, plaqueadas em condições migratórias e analisadas por microscopia de fluorescência de refletância interna total (TIRF) na presença de DPI. A área de adesão na presença de DPI (5 μM) foi maior quando comparada ao controle. Além disso, por ensaio de pull down, não observamos alterações na ativação de Rac1, indicando que os efeitos mediados por ERO estão relacionados com moléculas downstream a Rac1, como moléculas relacionas a adesão. Por fim, observamos a redução nos níveis de FAK-Y397 em células tratadas com NAC e DPI, indicando um aumento no tamanho de adesões focais. Esses resultados nos indicam que a geração local de ERO, principalmente às derivadas do complexo NADPH oxidase, pode modular a migração celular devido a mudanças na dinâmica de adesões a partir de vias de sinalização.

Cell migration requires the coordinated activation of structural and signaling molecules, such as the RhoGTPase Rac1. It is know that the NADPH oxidase complex assembly, which generates Reactive Oxygen Species (ROS) at the cell membrane, also relies on Rac1 activation, indicating a possible effect of ROS during cell migration. In this study, we evaluated the effect of NADPH-derived ROS on the migration process. CHO.K1 cells were plated on fibronectin (2 μg/ml) coated dishes in the presence/absence of the unspecific antioxidant N-acetyl-cysteine (NAC) or the NADPH-oxidase inhibitors Di-phenil-iodonium (DPI) and Acetovanilone. Using time-lapse videos, we observed that depletion of ROS by NAC (10 mM) induced a 60% decrease in migration speed and severely impacted migration directionality, which was also observed when NADPH oxidase was inhibited by DPI (10 μM). Then, we analyzed the effects of NADPH oxidase on three migratory events: protrusion rate, adhesion process and signaling pathways related to cell migration. By time-lapse movies, we observed that DPI induced an increase of ~3x protrusion/cell, which were twice faster but had a ~50% retraction when compared to control. In order to analyze adhesion dynamics, CHO.K1 cells were transfected with paxillin-GFP, plated on migrating promotion conditions and we analyzed adhesion dynamics with Total Internal Reflectance Fluorescence (TIRF) microscope in the presence of DPI. The adhesion area in the presence of DPI (5 μM) were larger when compared to control. Also, by pull down assay, we observed no changes on Rac1 activation, indicating that ROS-mediated effects were related to downstream molecules, such as adhesion-related molecules. Finally we had a reduction in FAK-Y397 levels in cells treated with NAC and DPI, indicating an increase on focal adhesion size. These results indicate that the local generation of NADPH-derived ROS can modulate cell migration due changes on adhesions dynamics and signaling.