Desenvolvimento in vitro de embriões bovinos produzidos por fecundação in vitro após microinjeção citoplasmática para a expressão epissomal transiente do gene IGF2

Abstract

Embriões bovinos produzidos in vitro por fecundação in vitro (PIV/FIV) e transferência nuclear (TN) apresentam diferenças bioquímicas, metabólicas, moleculares, histológicas e de desenvolvimento quando comparados aos seus equivalentes in vivo. Destacam-se anormalidades tanto pré-natais durante a placentação e mortalidade embrionária por subdesenvolvimento inicial, quanto pós-natais, caracterizados pela Síndrome do Neonato Anormal (AOS). Estudos evidenciam que há importantes alterações nos padrões de imprinting genômico embriões de PIV, especialmente no padrão de expressão de imprinting do sistema IGF, sendo o ligante IGF2, um gene de expressão paterna de caráter pleiotrópico e de efeito promotor de crescimento e diferenciação, e o receptor IGF2R, um gene de expressão materna que contrapõe os efeitos do gene IGF2. Assim, o presente estudo objetivou realizar a superexpressão epissomal transiente do gene IGF2 pela técnica de microinjeção citoplasmática em embriões bovinos no estádio de 1-célula produzidos por FIV visando o aumento da eficiência nos índices de desenvolvimento, cinética e qualidade embrionária in vitro até o Dia 7 de desenvolvimento. Após nove repetições, um total de 1.752 complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram maturados e fecundados in vitro e posteriormente segregados em seis grupos experimentais: um controle não-microinjetado, um controle microinjetado com tampão tris-EDTA, ou TE (0 ng/μL), e quatros grupos de microinjeção com doses crescentes (10, 20, 40, 80 ng/μL) do vetor de expressão epissomal do gene IGF2 acompanhado do gene da proteína GFP em TE. No Dia 2 de desenvolvimento, foram avaliadas as taxas de clivagem e sobrevivência pós-microinjeção, além do número de blastômeros, e no Dia 7 de desenvolvimento, após cultivo in vitro, avaliaram-se as taxas de blastocisto, estádio de desenvolvimento e qualidade embrionária, taxa de embriões fluorescentes e número total de células em blastocistos. A microinjeção citoplasmática de zigotos foi efetiva em dispor o vetor de expressão no ooplasma, independente dos grupos, com média de 58% de blastocistos com fluorescência positiva no Dia 7 de desenvolvimento. A dose de 10 ng/μL de microinjeção do vetor promoveu uma menor taxa de blastocistos (10,4%), porém com blastocistos em estádios mais avançados de desenvolvimento (93,0%), com melhor qualidade morfológica (73% de Grau 1) e maior número de células (116,0 ± 3,0) em relação ao controle FIV não microinjetado (23,3%, 75,0%, 58,0%, e 75,0 ± 6,8, respectivamente). Em resumo, a microinjeção de embriões com um vetor de superexpressão do gene IGF2 promoveu uma taxa de desenvolvimento similar aos controles, com diferenças quando se utilizou a dose de 10 ng/μL, com uma menor taxa de blastocistos, porém com maior cinética de desenvolvimento, qualidade morfológica e número de células totais, indicando um possível efeito promotor do crescimento do gene IGF2 no desenvolvimento de embriões bovinos de PIV, do estádio de 1-célula até blastocisto.

Bovine IVP embryos produced by in vitro fertilization (IVF) or nuclear transfer (TN) usually have significant biochemical, metabolic, molecular, histological and developmental differences through birth and beyond when compared to the in vivo counterparts. To note, prenatal abnormalities during placentation and embryonic mortality due to early underdevelopment, and postnatal clinical symptoms, collectively named the Abnormal Offspring Syndrome (AOS,) are common occurrences for IVP embryos. Studies show that important changes usually occur in the pattern of genomic imprinting in IVP embryos, especially in the imprinting pattern of the IGF system, with the IGF2 ligand being a pleiotropic paternally expressed gene with a growth promoting effect, and the receptor IGF2R being a maternal expressed gene that counteracts the effects of the IGF2 gene. Thus, the present study aimed to induce a transient episomal overexpression of the IGF2 gene in bovine IVP embryos following the cytoplasmic microinjection at the 1-cell stage for the increase in embryo development, kinetics and morphological quality up to Day 7 of development. After nine replicates, a total of 1,752 bovine cumulus-oocyte complexes (CCOs) were matured and fertilized in vitro and subsequently segregated into six experimental groups: a non-microinjected control group, a microinjected control group using only tris-EDTA buffer, or TE (0 ng/μL ), and four microinjection groups at increasing doses (10, 20, 40, 80 ng/μL) of the vector in TE for the episomal expression of the IGF2 and the GFP genes. On Day 2 of development, cleavage and post-microinjection survival rates were evaluated, in addition to the estimation of the number of blastomeres. On Day 7 of development, blastocyst rates and stage of development, embryo quality, GFP fluorescence and total cell numbers were evaluated in resulting blastocysts after in vitro culture. Cytoplasmic microinjection of zygotes was effective in delivering the expression vector into the ooplasm, irrespective of the groups, with 58% of positive GFP fluorescence in Day-7 blastocysts. Considering developmental rates and embryo kinetics, the 10 ng/μL microinjection vector dose promoted a lower blastocyst rate (10.4%), but with blastocysts at more advanced stages of development (93.0%), better morphological quality (73% Grade 1) and higher number of cells (116.0 ± 3.0) than non-microinjected IVF controls (23.3%, 75.0%, 58.0%, and 75.0 ± 6.8, respectively). In summary, the microinjection of embryos with an IGF2 gene overexpression vector promoted a developmental rate similar to IVF controls, with differences only when the 10-ng/μL dose was used, with a lower blastocyst rate, but with higher developmental kinetics, morphological quality and total number of cells, indicating a possible growth promoting effect of the IGF2 gene on development of bovine IVP embryos, from the 1-cell to the blastocyst stages.