Uso da bioengenharia para produzir substitutos cutâneos, por meio do cultivo de células-tronco e queratinócitos em matrizes nanoestruturadas produzidas por eletrospinning

Abstract

A engenharia de tecidos (ET) é uma ferramenta importante para a regeneração da pele. Os tratamentos disponíveis não são suficientes para evitar a formação de cicatriz e promover a cura do paciente. Portanto, o presente estudo teve por objetivo produzir um substituto cutâneo usando o polímero Poli-D,L-ácido láctico (PDLLA) para produzir o biomaterial. Para esta proposta, biomateriais foram construídos pela técnica de electrospinning e divididos em 3 grupos: 1) PDLLA, 2) PDLLA/NaOH (scaffolds de PDLLA cuja superfície foi hidrolisada com uma solução de NaOH a 0,75 M) e 3) PDLLA/Lam (scaffolds também hidrolisados com NaOH e com a ligação covalente da proteína laminina). Os biomateriais foram construídos com dois diâmetros diferentes de fibras, com a menor na parte superior das matrizes. Esses biomateriais foram caracterizados quanto à morfologia, o diâmetro da fibra, o tamanho dos poros, à degradabilidade e às suas características de hidrofilicidade. A ligação da laminina também foi investigada. Para as análises biológicas, as células-tronco mesenquimais (CTMs) foram então semeadas na parte inferior do scaffold e, após 24 horas, os queratinócitos da pele foram semeados na superfície oposta. Os grupos foram avaliados quanto à adesão de células no dia da semeadura e nos dias 7, 14 e 21 para análise da viabilidade celular. A partir do dia 7, os scaffolds foram submetidos a um sistema de cultura ar/líquido. Por fim, experimentos in vivo também foram realizados utilizando camundongos nude como modelo animal de queimadura. Seis grupos foram testados: (1) grupo lesão, onde os animais foram lesionados e uma gaze foi utilizada como cobertura (n=4); (2) PDLLA/Lam, scaffold hidrolisado com a ligação da laminina, sem células; (3) PDLLA sem células, (4) PDLLA/Lam com células; (5) PDLLA com células (n=6/grupo) e (6) animais saudáveis (n=4). Todos os animais receberam o mesmo padrão de defeito de 1cm2 , realizado no dorso dos animais, com exceção do grupo 6. Após a cirurgia, os animais foram acompanhados por um período de 9 dias. As fotografias foram obtidas no dia da cirurgia e no dia da eutanásia. Após esse período, metade da lesão foi utilizada para análise de histologia e a outra metade para a análise de expressão gênica. Como resultados, os scaffolds apresentaram-se com fibras bem formadas e aleatoriamente distribuídas. A hidrólise não afetou substancialmente a estrutura das fibras, mas foi suficiente para a ligação da laminina. O diâmetro das fibras grossas variou de acordo com o scaffold, ficando entre 3,197 a 4,622 µm. O tamanho dos poros também variou de acordo com o biomaterial, ficando de 19,182 a 27,732 µm. As fibras finas apresentaram diâmetro médio de 574 nm e tamanho médio de poro de 3,444 µm. O biomaterial de PDLLA/Lam mostrou as características mais hidrofílicas entre os três grupos analisados. Matrizes de PDLLA apresentaram peso molecular de 105-87 Da no 14º dia de análise. As matrizes de PDLLA/NaOH e PDLLA/Lam apresentaram peso molecular de cerca de 40-50 Da, resultante do processo de hidrólise. A ligação da laminina foi confirmada por ensaio de imunofluorescência. Em geral, em termos de análise biológica, o grupo de PDLLA/Lam apresentou os melhores resultados para a adesão e viabilidade celular. A presença de ambos os tipos de células foi observada por meio da análise histológica em todos os grupos de scaffolds (ou biomateriais), até 21 dias de cultivo. Além disso, observou-se claramente que as células ocuparam toda a estrutura das matrizes, em todos os grupos estudados. Após 9 dias de experimentos in vivo, não houve diferença estatística no tamanho do defeito entre os grupos, embora os grupos com o biomaterial PDLLA/Lam tenham tido uma tendência ao menor tamanho de lesão, assim como o grupo PDLLA/Lam apresentou o melhor aspecto visual da ferida. A análise da expressão gênica para os grupos de biomateriais mostrou aumento considerável da expressão de TGFβ1, aumento de VEGF e balanço (ou equilíbrio) da razão BAX/Bcl-2, quando comparado ao grupo controle lesão. A análise histológica mostrou tecidos bem formados nos grupos onde biomateriais e biomateriais com células foram utilizados. Em alguns animais do grupo biomateriais com células, a epiderme foi formada em toda a extensão da ferida. Não houve formação de anexos de pele em nenhum dos animais testados. Em conclusão, os biomateriais, principalmente os grupos PDLLA e PDLLA/Lam, mostraram bons resultados para a co-cultura das células, com boa adesão celular e a presença de células viáveis. Esses biomateriais foram capazes de proporcionar o suporte para o crescimento das células, o que indica que eles podem ser biomateriais adequados para utilização na engenharia de tecidos.

Tissue engineering (TE) is an important tool for skin regeneration. Currently available treatments are insufficient for preventing scar formation and promoting healing of the patient. Therefore, the current study has aimed to produce a cutaneous substitute using Poly- D,Llactic acid (PDLLA) polymer to produce the biomaterial. For this proposal, scaffolds were constructed by the electrospinning technique and divided into 3 groups: 1) PDLLA, 2) PDLLA/NaOH (PDLLA scaffolds hydrolyzed with a solution of NaOH 0.75M) and 3) PDLLA/Lam (also hydrolyzed with NaOH and in which the protein laminin was linked by covalent binding). They were constructed with 2 different fiber diameters, with the smallest at the top of the scaffold. These scaffolds were characterized by morphology, fiber diameter, pore size, degradability and their hydrophilicity features. Laminin linkage was also investigated. For biological analyses, mesenchymal stem cells were then seeded onto the bottom of the scaffolds and, after 24 hours, skin keratinocytes were seeded on the other side. The groups were evaluated for cell adhesion on the day of the seeding and on days 7, 14 and 21 for cell viability analysis. From day 7, the scaffolds were submitted to an air/liquid system culture. Finally, in vivo experiments were performed using nude mice as burn animal models. Six groups were tested: (1) animals injured without scaffolds (lesion group) in which gauze was used as a cover (n=4); (2) PDLLA/Lam, a hydrolyzed scaffold with the binding of laminin, without cells; (3) PDLLA without cells, (4) PDLLA/Lam with cells (n=6/group); (5) PDLLA with cells and (6) healthy animals (n=4). All the animals had a 1 cm2 defect performed on their backs, removing all the skin, with the exception of group 6. The scaffolds (or biomaterials) were implanted in the mice with burn imitation skin defects for up to 9 days. Photos were taken on the day of surgery and on the day of euthanasia. Two parts of the defect were taken for histology and gene expression analyses. The results showed scaffolds presenting well formed and randomly distributed fibers. The hydrolysis did not substantially affect the structure of the fibers but it was sufficient for laminin linkage. The fiber diameter varied for each biomaterial, being from 3.197 to 4.622 µm for the largest fibers. The pore size also varied accordind to the scaffold, being from 19.182 to 27.732 µm. The smallest fibers showed a diameter of 574 nm and a pore size of 3.444 µm. The PDLLA/Lam scaffolds demonstrated the greatest hydrophilic characteristics of the three groups. The molecular weight of the PDLLA matrices was approximately 105-87 Da on the 14th day of analysis. The PDLLA/NaOH and PDLLA/Lam scaffolds had a molecular weight of approximately 40-50 Da, as a result of the hydrolysis process. The linkage of the laminin was confirmed by immunofluorescence assay. In general, in terms of the biological analysis, the PDLLA/Lam group showed the best results for cell adhesion and viability tests. The presence of both types of cells was observed through histological analysis in the evaluation of all the groups up to 21 days of cultivation. Moreover, it was clearly observed that the cells occupied all the structure of the scaffolds in all the groups. After 9 days of in vivo experiments, defect size did not show statistical difference among the groups, although the groups with the PDLLA/Lam biomaterial had the lowest lesion size and the PDLLA/Lam group presented the best visual aspect of the wound. Gene expression analysis showed considerable increase of TGFβ1 expression, increased VEGF and balance of the BAX/Bcl-2 ratio, when compared to the lesion group. Histological analysis showed well-formed tissue in the groups where the biomaterials and biomaterials plus cells were used. In some animals in which biomaterials and cells were used, the epidermis was formed throughout the length of the wound. There was no formation of skin annexus in any of the animals tested. In conclusion, the PDLLA scaffolds, mainly the PDLLA/Lam groups, showed good results for the co-cultivation of the cells, with good cell adhesion and presence of viable cells. These biomaterials were capable of providing support for the growth of the cells, indicating that they can be suitable biomaterials for use in tissue engineering.