Análise do genótipo e fenótipo em pacientes brasileiros com hiperfenilalaninemias e doença da urina do xarope do bordo

Abstract

Introdução: As Aminoacidopatias são um grupo de Erros Inatos do Metabolismo onde defeitos em enzimas do metabolismo de aminoácidos causam o acúmulo de substratos metabólicos, que podem ser extremamente neurotóxicos. Entre as Aminoacidopatias, temos as Hiperfenilalaninemias Genéticas, que incluem a Fenilcetonúria, causada por variantes bialélicas do gene PAH, que codifica a fenilalanina hidroxilase, enzima responsável pela conversão da fenilalanina em tirosina. Temos ainda, a Deficiência de Tetrahidrobiopterina, que ocorre por defeitos nas vias de síntese de novo ou de reciclagem da tetrahidrobiopterina, um cofator da fenilalanina hidroxilase, entre outras enzimas. A via metabólica da Tetrahidrobiopterina é codificada pelos genes GCH1, GCHFR, PTS, PCBD1, QDPR e SPR. Variantes patogênicas nestes genes levam ao funcionamento incorreto desta via e consequentemente, defeitos nos neurotransmissores produzidos a partir dela. E também, as Hiperfenilalaninemias Genéticas podem ser causadas pela presença de variantes patogênicas no gene DNAJC12. Além das Hiperfenilalaninemias genéticas, temos a Doença da Urina do Xarope do Bordo, onde a via do complexo da desidrogenase dos alfa-cetoácidos de cadeia ramificada, codificada pelos genes BCKDHA, BCKDHB e DBT está defeituosa, levando ao acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, isoleucina e valina, além dos seus respectivos α-cetoácidos. Objetivos gerais: I. Realizar o diagnóstico molecular de pacientes com suspeita clínica e/ou bioquímica de Hiperfenilalaninemias e Doença da Urina do Xarope do Bordo através de sequenciamento massivo paralelo; II. Caracterizar o perfil genético de uma amostra de pacientes brasileiros com Fenilcetonúria; II. Caracterizar o perfil genético de uma amostra de pacientes brasileiros com Deficiência de Tetrahidrobiopterina; e III. Caracterizar o perfil genético de uma amostra de pacientes brasileiros com Doença da Urina do Xarope do Bordo. Metodologia: Esse estudo é transversal e possui uma amostragem por conveniência. Foram incluídos pacientes com diagnóstico bioquímico de Fenilcetonúria, Deficiência de Tetrahidrobiopterina e Doença da Urina do Xarope do Bordo. Para a análise genética, foi realizado o sequenciamento massivo paralelo na plataforma Ion Torrent Personal Genome MachineTM, 15 utilizando painel de genes contendo os genes envolvidos nestas três doenças (PAH, GCHFR, GCH1, PTS, QDPR, PCBD1, SPR, BCKDHA, BCKDHB e DBT). A análise de variantes ocorreu nos softwares Enlis Genome Research e Ion ReporterTM. A análise da profundidade do sequenciamento foi realizada no software IGV. Os bancos de dados PAHvdb, PNDdb, HGMD, Clinvar, gnomAD e ABraOM foram utilizados. A patogenicidade das variantes foi determinada pelos critérios do American College of Medical Genetics and Genomics. Dados clínicos foram obtidos através de revisão de prontuários. Variantes novas e conflituosas foram analisadas pelo sequenciamento automatizado de Sanger. A associação genótipo-fenótipo, quando possível, foi efetuada com o apoio do banco de dados BioPKU e de informações da literatura. A modelagem molecular foi realizada utilizando-se sequências da proteína selvagem do Protein Data Bank, com os softwares DeepView, I-TASSER e FoldX 5.0. Resultados: Nos 33 pacientes não relacionados com Fenilcetonúria, foram identificadas 26 variantes patogênicas diferentes, sendo uma nova (c.524C>G), está classificada como potencialmente patogênica. As variantes mais frequentes encontradas foram c.1315+1G>A (n = 8/66), c.473G>A (n = 6/66), e c.1162G>A (n = 6/66). Na Deficiência de Tetrahidrobiopterina, foram analisados quatro pacientes (duas irmãs), nos quais se identificou seis variantes no gene PTS, destas três novas: c.84-2A>G, c.134A>T e c.403A>G. A última prevista como potencialmente patogênica, enquanto as demais são classificadas como patogênicas. Nos dezoito pacientes com a Doença da Urina do Xarope do Bordo analisados, foram encontradas 21 variantes, sendo sete novas: c.1237C>T no gene BCKDHA e c.80_90dup, c.384delA, c.478A>T, c.528C>G, c.977T>C e c.1039- 2A>G no gene BCKDHB. Todas as variantes novas foram classificadas como patogênicas. Não foram encontradas variantes frequentes nos pacientes analisados. A maioria das variantes encontradas se concentram no gene BCKDHB. Conclusões: Foram encontradas 26 variantes no gene PAH, incluindo uma variante nova e com isso se evidencia a heterogeneidade alélica do gene PAH. Em 27,7% dos pacientes, que não haviam realizado o teste de responsividade a tetrahidrobiopterina, foi possível obter a provável responsividade de acordo com os dados disponíveis no banco de dados BioPKU. Ainda, 30,3% dos pacientes corroboraram os dados disponíveis no banco de dados e 12,1% dos pacientes 16 apresentaram divergência em relação aos dados disponíveis no banco. Na Deficiência de Tetrahidrobiopterina, foi possível complementar o diagnóstico de três pacientes, todos com alterações no gene PTS e três variantes novas foram identificadas. No entanto, não foi possível realizar as associações genótipo-fenótipo nestes pacientes. Por fim, os pacientes com a Doença da Urina do Xarope do Bordo mostraram um perfil genético heterogêneo, com variantes nos três principais genes causadores da doença. No total, 21 variantes foram identificadas, sete novas. Associações genótipo-fenótipo neste gene não foram possíveis devido a heterogeneidade alélica e divergências entre as informações clínicas dos pacientes por conta do diagnóstico tardio.

Introduction: Aminoacidopathies are a group of inborn errors of metabolism, caused by deficiency in enzymes involved in amino acid metabolism, which lead to the accumulation of the substrate, whom can be extremely neurotoxic. Between the aminoacidopathies, there are the genetic hyperphenylalaninemia, which comprises phenylketonuria, a disease caused by biallelic variants in the PAH gene. This gene encodes the phenylalanine hydroxylase, the enzyme that converts phenylalanine into tyrosine. We also have the tetrahydrobiopterin deficiency, a cofactor to the phenylalanine hydroxylase and other enzymes. This condition can be caused by pathogenic variants in genes involved in the tetrahydrobiopterin biosynthesis or regeneration (e.g.: GCH1, GCHFR, PTS, PCBD1, QDPR, and SPR), leading to defects in neurotransmitters generated after this pathway. Besides the genetic hyperphenylalaninemia, there is the maple syrup urine disease, caused by variants in the genes that encodes elements of the branched-chain a-ketoacid dehydrogenase complex (BCKDC) pathway (e.g., BCKDHA, BCKDHB, and DBT), leading to the accumulation of the branched-chain amino acids leucine, isoleucine and valine, and their respective a-ketoacids. Aims: I. Perform the molecular diagnosis of the patients with clinical or biochemical suspect of genetic hyperphenylalaninemia and maple syrup urine disease through massive parallel sequencing; II. Characterization of the genetic profile from a sample of phenylketonuria’s Brazilian patients; III. Characterization of the genetic profile from a sample of Brazilian patients diagnosed with tetrahydrobiopterin deficiency; and IV. Characterization of the genetic profile of the maple syrup urine disease Brazilian patients. Methodology: This is a transversal study, with a convenience sample. We included patients with biochemical diagnosis of phenylketonuria, tetrahydrobiopterin deficiency, and maple syrup urine disease. For the genetic analysis, we performed the massive parallel sequencing in the Ion Torrent Personal Genome MachineTM platform, using a gene panel containing the genes for the diseases previously described. The variant filtering was performed in the Enlis Genome Research and Ion ReporterTM software. IGV software was used to the detection of the depth of sequencing. The databases PAHvdb, PNDdb, HGMD, ClinVar, gnomAD, and 18 ABraOM were consulted. The pathogenicity of the variants was determined by the American College of Medical Genetics and Genomics criteria. Novel and conflicting variants were analyzed by automated Sanger sequencing. Genotype-phenotype association, when it was possible, was performed using the BioPKU database and literature review. Molecular modelling was performed with the wild type protein sequence from Protein Data Bank and the softwares DeepView, I-TASSER, and FoldX 5.0. Results: In the phenylketonuria’s patients, 26 different pathogenic variants were identified, and of those, one variant (c.524C>G) was novel and classified as likely pathogenic. The most frequent variants found were c.1315+1G>A (n = 8/66), c.473G>A (n = 6/66), and c.1162G>A (n = 6/66). In the four patients with tetrahydrobiopterin deficiency analyzed (two siblings), six variants of the PTS gene were found, three of them novel: c.84-2A>G, c.134A>T, and c.403A>G. The first two variants were classified as 520pathogenic and the last one as likely pathogenic. In the eighteen patients diagnosed with maple syrup urine disease, 21 variants were found and of those, seven were novel: c.1237C>T in the BCKDHA gene, and c.80_90dup, c.384delA, c.478A>T, c.528C>G, c.977T>C, and c.1039-2A>G in the BCKDHB gene. All the variants were classified as pathogenic. We did not found frequent variants in the analyzed patients and most of them were found located in the BCKDHB gene. Conclusions: Our study shows high allelic heterogeneity in the PAH gene, with 26 variants in the PAH gene, including a novel variant. Using data from BioPKU it was possible to infer the tetrahydrobiopterin responsivity of 27.7% of the patients, that did take the responsivity test. On 30.3% of the patients, the BioPKU data corroborated with the biochemical assay while for 12.1% it did not. It the tetrahydrobiopterin deficiency it was possible to complement the diagnosis of three patients, all with alterations in the PTS gene and three novel variants where identified. However, it was not possible to establish a genotype-phenotype association for these patients. At least, patients with the maple syrup urine disease presented a more heterogeneous genetic profile, with variants found in the three main related genes. In total, 21 variants were identified, including seven novel. Genotype-phenotype association was not established in these patients as there was allelic heterogeneity, and divergence between the patients’ medical story due to the late diagnosis’.