Investigação de biomarcadores em modelos de camundongos com Mucopolissacaridose I e II

Abstract

As mucopolissacaridoses (MPS) são doenças herdáveis causadas pela ausência ou deficiência das enzimas lisossômicas responsáveis pelo catabolismo de glicosaminoglicanos (GAGs). A MPS I, ou síndrome de Hurler/Scheie, é caracterizada pela deficiência da enzima α-L-iduronidase (IDUA), já MPS II, ou síndrome de Hunter, pela deficiência da enzima iduronato-2-sulfatase (IDS). Ambas acumulam os GAGs Dermatan Sulfato (DS) e Heparan Sulfato (HS), e ambas são de herança recessiva, sendo a MPS II ligada ao X. O diagnóstico bioquímico dessas doenças pode ser realizado através de ensaios de atividade enzimática, sequenciamento de DNA ou por quantificação de GAGs. A quantificação de GAGs, por sua vez, pode ser feita através de várias técnicas, dentre elas, a mais recente e que foi utilizada nesse trabalho é a cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas em tandem (LC/MS/MS). Embora diversas amostras possam ser utilizadas para essa quantificação, aqui foram utilizadas amostras de sangue impregnado em papel filtro para quantificação de GAG e atividade enzimática em MPS I. Já em MPS II foram usadas amostras de soro, urina, órgãos e saliva para quantificação de GAGs. Os camundongos com MPS I, cujas amostras foram coletadas em torno de 2 meses, apresentaram níveis elevados de GAGs no sangue, ao serem comparados com controles não afetados. Além disso, camundongos com MPS I tiveram a já esperada baixa atividade enzimática de IDUA, mas também apresentaram uma atividade elevada da enzima lisossômica αgalactosidase A (GLA), possivelmente causada pela ativação do Fator de Transcrição EB (TFEB) após armazenamento lisossomal de moléculas não degradadas. Esse foi o primeiro relato de atividade enzimática de GLA aumentada em MPS I. Para MPS II, aos 6 meses foi observado que não havia diferença significativa entre os níveis de GAG do soro entre os grupos, já para a urina na mesma idade se observou níveis elevados de DS e HS em camundongos com MPS II. Foram constatados níveis elevados de GAGs em todos os órgãos dos animais com MPS II aos 6 meses, se comparados aos controles não afetados. Especificamente para as partes do cérebro, não se observou diferenças significativas no nível de GAG no cerebelo. Já no córtex frontal e total, observou-se níveis elevados de HS nos camundongos com MPS II, ajudando a confirmar a proposição de que as células do sistema nervoso central têm acúmulo unicamente desse GAG. Finalmente, observou-se diferenças significativas aos 6 meses, com os valores de GAG elevados nos camundongos com MPS II. Esse foi o primeiro relato de níveis de GAG na saliva como possível ferramenta auxiliar para o diagnóstico de MPS II. Esses achados podem ajudar a estabelecer biomarcadores em diferentes tecidos ou fluidos fisiológicos, ajudando a melhor caracterizar e monitorar essas doenças.

Mucopolysaccharidosis (MPS) are heritable diseases caused by absence or deficiency of lysosomal enzymes responsible for the catabolism of glycosaminoglycans (GAG). MPS I, or Hurler/Scheie syndrome, is characterized by the deficiency of the α-L-iduronidase (IDUA) enzyme, whereas MPS II, or Hunter syndrome, by the deficiency of the iduronato-2-sulfatase (IDS) enzyme. Both accumulate the GAGs dermatan sulfate (DS) and heparan sulfate (HS), and both present a recessive inheritance, being MPS II a X linked condition. The biochemical diagnosis of these diseases can be performed by enzyme activity assays, DNA sequencing, or GAG quantification. GAG quantification, specifically, can be performed by multiple techniques, among them, the most recent and used on this work is liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Here blood samples in filter paper were used to quantify GAGs and enzyme activity in MPS I mice. For MPS II, we used samples of serum, urine, organs, and saliva to quantify GAGs. MPS I mice, whose samples were collected at about 2 months, showed high levels of GAGs in the blood, compared to Wild Type (WT). Moreover, MPS I mice had the already expected low enzymatic activity of IDUA, and an elevated enzymatic activity of the lysosomal enzyme α-galactosidase A (GLA), possibly caused by the activation of the Transcription Factor EB (TFEB). This was the first report of an elevated activity of GLA in MPS I. For MPS II, at 6 months it was observed that there was no significant difference of GAG levels in the serum between the groups, but for urine at the same age it was observed higher levels of DS and HS in MPS II mice. Elevated GAG levels were found in all organs of MPS II mice at 6 months, when compared to WT. Specifically for brain areas, there was a lack of meaningful difference between the groups for the levels of GAG in the cerebellum, but we observed HS elevation in frontal and total cortexes. Finally, higher GAG levels were found in the saliva of MPS II mice at 6 months. This was the first report of elevated GAG levels in saliva in MPS II. These findings may help stablish biomarkers in different physiological fluids and tissues, helping better characterize and monitor these diseases.