Edição gênica em mucopolissacaridose tipos I e II utilizando o sistema CRISPR-Cas9 : uma abordagem não-invasiva para o tratamento do comprometimento neurológico e sistêmico

Abstract

As Mucopolissacaridose tipo I e tipo II são doenças de depósito lisossomal causadas por variantes patogênicas em genes que codificam para as enzimas lisossomais IDUA e IDS, respectivamente. A ausência ou mau funcionamento dessas enzimas leva a um comprometimento da via catabólica dos glicosaminoglicanos Heparan e Dermatan sulfato, que resulta em um acúmulo progressivo desses substratos em lisossomas de múltiplos tecidos. As manifestações fenotípicas dos pacientes podem variar da forma atenuada à grave, sendo malformação esquelética, rigidez articular, doença valvar pulmonar e cardíaca e hepatoesplenomegalia as mais comuns. O comprometimento do sistema nervoso central é a característica mais preocupante entre os fenótipos graves em ambas as doenças. A falta de tratamentos eficazes e seguros que retardem ou previnam os sintomas neurológicos e somáticos leva à busca de abordagens inovadoras que superem as limitações das terapias existentes. Assim, o objetivo geral desta tese foi propor uma abordagem de edição de genoma usando vetor não-viral visando ao tratamento dos sintomas neurológicos em MPS I e II. Neste trabalho preparamos, caracterizamos e testamos in vivo um vetor lipossomal capaz de transportar e entregar o sistema CRISPR-Cas9 ao cérebro para correção gênica em camundongos MPS I e II pela via nasal. Nosso complexo foi capaz de atingir e editar células no bulbo olfatório, o coração e pulmões após trinta administrações nasais, e as células editadas foram capazes de produzir cerca de 1% dos níveis normais de enzimas, o que levou a uma diminuição do acúmulo de substrato em alguns tecidos, urina e soro em camundongos MPS I e II. Isso também significou uma melhora nas características motoras e de memória em camundongos MPS I e II. Por fim, comprovamos que nosso sistema não foi capaz de melhorar sua eficácia com o uso trinta administrações adicionais, uma vez que não foram observadas melhoras metabólicas e fenotípicas maiores após sessenta doses em comparação com trinta doses. Assim, esses achados sugerem que uma otimização de todo o sistema proposto é necessária para atingir níveis mais elevados de eficácia e eficiência do sistema. No entanto, esta abordagem não viral e não invasiva pode ser promissora para o tratamento de sintomas neurológicos e somáticos após abordar suas limitações reais.

Mucopolysaccharidosis type I and Type II are lysosomal storage diseases caused by pathogenic variants on genes encoding for lysosomal enzymes IDUA and IDS, respectively. The absence or malfunction of these enzymes leads to impaired degradation of glycosaminoglycans Heparan and Dermatan sulfate, which causes progressive accumulation of these substrates in lysosomes of multiples tissues. The patient's phenotypical manifestations can vary from the mild to the severe form, being skeletal malformation, stiffened joints, pulmonary and heart valve disease, and hepato-splenomegaly the most commons. Central nervous system impairment is the most concerning feature among severe phenotypes in both diseases. The lack of effective and safe treatments that delay or prevent neurological and somatic symptoms lead to seeking out innovative approaches that may overcome the limitations of the existing therapies. Thus, the overall objective of this thesis was to propose a non-viral genome editing approach targeting neurological symptoms in MPS I and II. In this work we prepared, characterized, and tested in vivo a liposomal vector capable of carrying and delivering the CRISPR-Cas9 system to the brain for gene correction in MPS I and II mice using the nasal route. Our complex was capable of reaching and editing cells in the olfactory bulb, the heart, and lungs after thirty nasal administrations, and edited cells were able to produce about 1 % of the normal enzyme levels which led to a decrease in of glicosaminoglycan levels in some tissues, urine and serum in MPS I and II mice. This also produced an improvement in motor and memory behaviors. Finally, we proved that our system was unable to improve its efficacy when sixty administrations were used, since no metabolic and phenotypic changes were seen after sixty doses compared to thirty doses. Thus, these findings suggest that a major optimization of the whole system proposed is necessary to achieve higher levels of efficacy and efficiency. Nevertheless, this non-viral and non- invasive approach may hold promise for the treatment of neurological and somatic symptoms after addressing its actual limitations.