Desenvolvimento de estratégias para regeneração cutânea com base em um biomaterial nanofibroso de PLGA/fibrina e secretoma de células-tronco

Abstract

Introdução: Até os dias de hoje, as feridas crônicas e queimaduras representam um problema grave de saúde pública que trazem consequências devastadoras para os pacientes e resultam em grandes custos para os sistemas de saúde e para a sociedade. Objetivo: O presente trabalho teve como objetivo desenvolver estratégias para a regeneração cutânea com base em um biomaterial nanofibroso de PLGA/fibrina e secretoma de células-tronco. Metodologia: A primeira estratégia consistiu no desenvolvimento de um biomaterial (scaffold) nanofibroso eletrofiado composto pelos polímeros: ácido poli(lático-co-glicólico) (PLGA), fibrina e polietileno glicol. Os scaffolds foram caracterizados por meio de testes físicos e biológicos. Para a análise in vivo, à membrana de electrospinning gerada foi adicionada uma camada de hidrogel de fibrina para construir um substituto dermo-epidérmico que foi analizado em um modelo de lesão cutânea de espessura completa em ratos. Os fibroblastos e queratinócitos foram isolados de biopsias de pele de rato, os fibroblastos foram cultivados na camada do hidrogel de fibrina e os queratinócitos na membrana eletrofiada para gerar um substituto cutâneo. Os scaffolds sem e com incorporação de células foram implantados e os tecidos neoformados analisados. A segunda estratégia consistiu na avaliação dos efeitos do secretoma de células-tronco derivadas de dentes decíduos esfoliados humanos (SHED) em queratinócitos. As vesículas extracelulares (VEs) de SHED foram isoladas e caracterizadas. Resultados: A caracterização por microscopia eletrônica de varredura mostrou nanofibras depositadas aleatoriamente e a incorporação de fibrina reduziu o diâmetro médio de 1051.0 ± 290.2 nm nos scaffolds de PLGA para 639,8 ± 241,8 nm nas membranas de PLGA/fibrina. A análise de FTIR confirmou a presença de fibrina nas membranas e a incorporação de fibrina reduziu o ângulo de contato. A fibrina aumentou a tensão e diminuiu a deformação do biomaterial. Os scaffolds demonstraram compatibilidade sanguínea e a incorporação de fibrina melhorou a adesão e viabilidade celular. Os testes in vivo não indicaram sinais de infecção nas feridas. Não houve diferença entre os grupos sem e com células (grupos 1 e 2, respectivamente) quando analisadas a espessura epitelial, a espessura do tecido de granulação e o índice de colágeno. No entanto, se observou diferença significativa entre esses grupos e o grupo controle negativo. Também, observou-se aumento da deposição de colágeno nos grupos 1 e 2 no dia 14 e remodelação epitelial nos grupos 1 e 2 no dia 21. Os marcadores de cicatrização de feridas mostraram aumento da expressão de proteínas antiinflamatórias e fator de crescimento epidérmico (EGF) no grupo 1. Em contrapartida, não houve diferença na expressão de fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) entre os grupos. As atividades de glutationa peroxidase e superóxido dismutase foram diminuídas em relação ao controle positivo e negativo. As SHED-VEs revelaram uma morfologia em forma de taça, expressaram os marcadores clássicos para exossomos CD9 e CD63, e foram efetivamente internalizadas pelos queratinócitos. Os resultados também indicaram que 50% de meio condicionado (MC) e 0,4 μg/ml de VEs foram igualmente eficientes para melhorar a viabilidade, migração e atenuação da citotoxicidade induzida por H2O2 em queratinócitos. Além disso, a expressão de VEGF em queratinócitos aumentou quando tratados com secretoma e VEs de SHED. Conclusões: Os resultados sugerem que a incorporação de células nos scaffolds em bicamada não influenciou nas características histológicas do tecido de granulação e epitélio, bem como no índice de colágeno. Os scaffolds bicamada contribuíram para a formação do tecido de granulação e na deposição precoce de colágeno, mantendo um microambiente antiinflamatório. Por outro lado, o secretoma e VEs de SHED mostraram ser eficientes para melhorar a viabilidade, migração e atenuação da citotoxicidade induzida por H2O2 em queratinócitos. Portanto, tanto o scaffold bicamada, quanto o secretoma de SHED podem ser ferramentas terapêuticas promissoras para acelerar a reepitelização e cicatrização de feridas.

Introduction: Until the present day, chronic wounds and burns represent a serious public health problem that has devastating consequences for patients and which contribute to high costs for healthcare systems and societies. Objective: The present work aimed to develop strategies for skin regeneration based on a nanofibrous biomaterial of PLGA/fibrin and stem cell secretome. Methodology: The first strategy consisted of the development of an electrospun hybrid nanofibrous scaffold composed of polymers: poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA), fibrin and polyethylene glycol. The scaffolds were characterized through physical and biological tests. For in vivo analysis, a layer of fibrin hydrogel was added to the generated electrospinning membrane to construct a dermo-epidermal substitute which was tested in a full-thickness skin lesion model in rats. Fibroblasts and keratinocytes were isolated from rat skin biopsies, fibroblasts were cultivated on the fibrin hydrogel layer and keratinocytes on the electrospun membrane to generate a skin substitute. Scaffolds with and without cells were implanted and the neoformed tissues were analyzed. The second strategy consisted of the evaluation of the stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) secretome in relation to viability, migration, and attenuation of the cytotoxicity induced by H2O2 in the keratinocytes. Extracellular SHED vesicles were isolated and characterized. Results: scanning electron microscopy (SEM) characterization showed randomly oriented nanofibers and the incorporation of fibrin reduced the mean diameter from 1051.0 ± 290.2 nm in PLGA scaffolds, to 639.8 ± 241.8 nm in PLGA/fibrin membranes. FTIR analysis confirmed the presence of fibrin in the membranes and the incorporation of fibrin reduced the contact angle. The fibrin increased tensile strength and decreased elongation at break. The scaffolds demonstrated blood compatibility and fibrin incorporation improved cell adhesion and viability. In vivo tests showed no signs of wound infection. There was no difference between the groups without and with cells (groups 1 and 2, respectively) when analyzing epithelial thickness, granulation tissue thickness, and collagen index. However, a significant difference was observed between these groups and the negative control group. In addition, increased collagen deposition was observed in groups 1 and 2 on day 14 and epithelial remodeling in groups 1 and 2 on day 21. Wound healing markers showed increased expression of anti-inflammatory proteins and epidermal growth factor in group 1. In contrast, there was no difference in vascular endothelial growth factor (VEGF) expression between the groups. The glutathione peroxidase and superoxide dismutase activities were decreased in relation to the positive and negative control. The SHEDVEs revealed a cup-shaped morphology, expressing the classic markers for the exosomes CD9 and CD63, and were effectively internalized by keratinocytes. The results also indicated that 50% conditioned medium (CM) and 0.4 μg/ml EVs were equally efficient in improving viability, migration, and attenuation of H2O2 induced cytotoxicity in the keratinocytes. Furthermore, VEGF expression in keratinocytes increased when treated with SHED secretome and EVs. Conclusions: The results suggest that the incorporation of cells in the bilayer scaffolds did not influence the histological characteristics of the granulation tissue and epithelium, or the collagen index. The bilayer scaffolds contributed to the formation of granulation tissue and early collagen deposition, maintaining an anti-inflammatory microenvironment. On the other hand, the SHED secretome and EVs proved to be efficient in improving the viability, migration and attenuation of H2O2 induced cytotoxicity in the keratinocytes. Therefore, both the bilayer scaffold and the SHED secretome may be promising therapeutic tools for accelerating re-epithelialization and wound healing.