Adaptação metabólica em melanomas : revisão de literatura, caracterização de um modelo celular pré-clínico e validação clínica do fenótipo slow-clycling

Abstract

O melanoma é um câncer de pele causado pelo crescimento anormal de células pigmentares (melanócitos), principalmente na pele e nas mucosas. É um dos tipos mais graves de câncer de pele, pois tem alto potencial metastático. Em casos avançados, a doença é difícil de ser controlada, resultando em uma baixa expectativa de vida. Estudos recentes indicam que fatores não genéticos influenciam a heterogeneidade do melanoma, sendo um subgrupo celular principalmente responsável pela recidiva. Contudo, não existe um consenso na literatura sobre esse perfil celular, comumente chamado de ciclagem lenta (do inglês, slow-cycling), ou modelos celulares com características inerentes desse fenótipo. Levando isso em consideração, escolhemos o modelo celular desenvolvido pela transfecção do gene da catalase na linhagem A375, originando os clones A375-G10 (G10) e A375-A7 (A7) que demonstram padrões de diferenciação e agressividade complementares. Assim, o objetivo dessa tese foi revisar a literatura na busca de marcadores e características para definir o fenótipo de ciclagem lenta para, então, verificar o potencial das células A7 e G10 como modelo de estudo desse fenótipo, e, finalmente, validar seu poder prognóstico e preditivo em amostras clínicas. Tanto a superexpressão quanto a diminuição do nível de expressão do fator de transcrição associado à microftalmia (MITF) demonstraram desempenhar um papel no desenvolvimento de ciclagem lenta no melanoma. A superexpressão e a baixa expressão desses genes estão envolvidas na regulação da diferenciação e resistência aos tratamentos. A alta expressão de MITF promove um fenótipo diferenciado devido à regulação positiva dos genes MITF, MLANA, TYR. No entanto, as células de ciclagem lenta com baixa expressão de MITF, também conhecido como MITFlow, apresenta enriquecimento de genes relacionados a transição epitelial-mesenquimal (EMT), sinalização TGFβ, assim como alta expressão de expressão da JUN, BRN2 e AXL. Independente da expressão de MITF, o fenótipo de ciclagem lenta apresenta um estado quiescente, sendo seu metabolismo dependente de respiração mitocondrial. Ao investigar essas características no modelo celular composto por A7 e G10, observamos que a linhagem G10 apresenta aumento da parada do ciclo celular G0/G1, e maior atividade de β-galactosidase lisossômicas, assim como aumento na expressão de genes relacionados ao as células ciclagem lenta MITFlow. Além disso, demonstramos que G10 apresentam elevado consumo de oxigênio, aumento no número de mitocôndrias, e maior imunoconteúdo de proteínas da fusão mitocondrial em comparação a célula A7. Dessa forma, observamos que a linhagem G10 apresenta enriquecimento de características do fenótipo de ciclagem lenta. Posteriormente, analisamos a expressão diferencial de genes relacionados a esse perfil celular em banco de dados de pacientes com melanoma. Para nossa surpresa, dos seis bancos analisados, apenas dois demostraram diferença estatística. Além disso, a análise mostrou que a maioria desses genes apresentam expressão reduzida. Ao estratificar os dados do banco GSE65185 entre a alta ou baixa resposta (maior ou menor que a média) das amostras de pacientes, antes da intervenção terapêutica, e analisar a expressão dos genes MITF, notamos que a maioria de pacientes com baixa resposta terapêutica apresenta baixa expressão de MITF. Nesse sentido, trazemos à tona a discussão sobre a dificuldade de encontrar na clínica um fenótipo celular descrito extensivamente in vitro como principal fator na agressividade do melanoma.

Melanoma is a type of skin cancer caused by the abnormal growth of pigment cells (melanocytes) mainly in the skin and mucous membranes. It is one of the most serious types of skin cancer and has a high metastatic potential. In advanced cases, the disease is difficult to control, resulting in a low life expectancy. Recent studies indicate that non-genetic factors influence the heterogeneity of melanoma, being a subgroup of cells responsible for recurrence. Conversely, there is no consensus in the literature about this cellular profile, commonly called slow-cycling, or cellular models with inherent characteristics of that phenotype. Taking this into account, we chose the cell model developed by transfecting the catalase gene into A375 cell line, originating the clones A375-G10 (G10) and A375-A7 (A7) which demonstrate patterns of differentiation and aggressiveness complementary. Thus, the objective of this thesis was to determinate markers and characteristics to define the slow-cycling, and then verify the potential of the model composed of A7 and G10 as a study model of this phenotype, validating it in patient data. Both overexpression and decreased expression level of microphtalmiaassociated transcription factor (MITF) have been shown to play a key role in the development of melanoma. The hyperactivation or low expression of this gene is involved in the regulation of differentiation and resistance to treatments. The high expression of MITF promotes a differentiated phenotype due to the upregulation of the MITF, MLANA, TYR genes. However, slow-cycling cells with low expression of MITF, also known as MITFlow, show enrichment of genes related to epithelial-mesenchymal transition (EMT), TGFΒ signaling, as well as upregulation of JUN, BRN2 and AXL. Regardless of MITF expression, the slow-cycling phenotype presents a quiescent state, and its metabolism dependeds on mitochondrial respiration. When investigating these characteristics in the cell model composed of A7 and G10, we observed that the G10 cell line shows an increase in the G0/G1 cell cycle arrest, and greater activity of lysosomal β-galactosides, as well as an increase in the expression of genes related to MITFlow. In addition, G10 shown increased oxygen consumption, higher mitochondria numbers per cell, and greater immunocontent of mitochondrial fusion proteins compared to cell A7. Hence, we observed that the G10 lineage presents enrichment of slowcycling phenotype characteristics. Subsequently, we analyzed the differential expression of genes related to this cell profile in a database of patients with melanoma. To our surprise, of the six databese analyzed, only one showed a statistical difference. Furthermore, the analysis showed that most of these genes have reduced expression. By stratifying the data from this GSE65185 database between high or low response (greater or less than the mean) of the patient samples before the therapeutic intervention, we analyzed the expression of the MITF. In this sense, the majority of patients with low response therapy has low expression of MITF. In this sense, we bring up the discussion about the difficulty of finding in the clinic the cellular phenotype extensively described in vitro as the main factor in the aggressiveness of melanoma.