Bases moleculares da ativação da enzima conversora de angiotensina I (ECA) na hipertrofia cardíaca no rato

Abstract

Neste trabalho demonstramos que seqüências regulatórias contidas na região promotora do gene da enzima conversora de angiotensina I (ECA) participam da ativação do gene durante o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca no rato. Para determinar a atividade da ECA no plasma e em diferentes tecidos na hipertrofia cardíaca foi necessário padronizar uma metodologia para medida da atividade da enzima em diversos tecidos de ratos. Isoproterenol (0,3 mg/Kg/dia, sc, 1 semana) resultou em hipertrofia cardíaca (36%) com aumento da expressão (58%) e da atividade da ECA (67%) no ventrículo esquerdo. O sistema de gene reporter baseado na luciferase foi utilizado para identificar as seqüências regulatórias do gene da ECA associadas a esta resposta. O desenvolvimento de hipertrofia se acompanhou de ativação da luciferase (3,5X) numa construção contendo 1273 pb do promotor da ECA indicando, assim, a presença de seqüências que ativam o gene no fragmento estudado. O mapeamento das seqüências regulatórias do gene da ECA associada a ativação do gene foi feita através da análise de uma série de mutantes contendo deleções progressivas do promotor (-1089, -477, -385, -252, -199, e -94 pb). Os dados obtidos sugerem que seqüências regulatórias importantes para ativação do gene da ECA durante o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca estão localizados no intervalo entre -1089 e -477 pb do promotor. Nesta região existem várias seqüências regulatórias que potencialmente poderiam participar desta resposta. Baseado em dados prévios do laboratório a seqüência "CRE-like" que responde a estimulação por AMPc foi analisada. Estudos envolvendo mutagênese sítio dirigida desta seqüência, entretanto, excluíram esta possibilidade. Em conjunto, os resultados demonstram que seqüências regulatórias contidas no intervalo -1089 a -477 pb do promotor causam o aumento de expressão da ECA durante o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca no rato.

ln the present report we demonstrated that regulatory sequences contained within the angiotensin-converting enzyme (ACE) promoter lead to the activation of the ACE gene during the development of the rat cardiac hypertrophy. To determine the activity of ACE in the plasma and different tissues during the isoproterenol induced hypertrophy, it was necessary to standardize the assay for determination of tissue ACE activity in rats tissues. Then, to gain insight on the molecular mechanisms underlying the activation of the ACE gene, we used a reporter gene system based on the luciferase gene. A 5' ACE-luciferase construct containing -1273 bp and delection fragments -1089, -477, -385, -252, -199 and -94 bp upstream of the transcription initation site of the rat ACE gene fused to the luciferase gene reporter were injected directly into the left ventricle wall to characterize promoter function. The isoproterenol treatment induced hypertrophy (36%) and increased significantly luciferase express1on (3,5X) in animals injected with fragments promoter containing -1273 bp indicating the presence of regulatory sequences in this fragment. To map the regulatory regions within the promoter a series of deletion mutants were investigated. The data suggested that regulatory regions contained within the interval -477 and -1089 bp participate of the activation of the gene during the development of hypertrophy. A CRE-like sequence contained in this interval became a potential candidate to be investigated. Site directed mutagenesis of this sequence excluded this sequence as a player associated with ACE activation. Taken together, these results give important information regarding the molecular mechanisms underlying ACE gene activation during the development of hypertrophy in rats.