Influência do tratamento com cafeína no desenvolvimento dos neurônios corticais e na ansiedade no modelo murino do TDAH

Abstract

O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é um dos transtornos neuropsiquiátricos do desenvolvimento mais comuns, sendo caracterizado por sintomas de desatenção, hiperatividade e impulsividade. O TDAH pode ser frequentemente acompanhado de sintomas comórbidos como a ansiedade, o que dificulta o gerenciamento do tratamento em crianças. Embora o fármaco metilfenidato seja a primeira escolha de tratamento, cerca de 30% dos pacientes diagnosticados com TDAH não respondem ou toleram o tratamento. Portanto, outras estratégias farmacológicas ainda se fazem necessárias para o tratamento dos sintomas do TDAH. A cafeína é o psicoestimulante mais consumido em todo o mundo, seu alvo molecular é o antagonismo dos receptores de adenosina A1 e A2A. Apesar dos efeitos benéficos da cafeína nos prejuízos cognitivos observados no modelo experimental do TDAH, evidências sobre os seus efeitos no perfil de ansiedade são pouco conhecidas. Além disso, abordagens celulares dos efeitos da cafeína nos modelos animais do TDAH foram pouco investigadas. Nesta tese, foram investigadas as diferenças entre os sexos no perfil de ansiedade em animais infantes do modelo animal mais utilizado para o estudo do TDAH, que são os ratos espontaneamente hipertensos, do inglês Spontaneously hypertensive rats (SHR), bem como as respostas ao tratamento com cafeína. Paralelamente, buscou-se encontrar alterações morfológicas durante o desenvolvimento in vitro de neurônios corticais do modelo animal do TDAH, e os efeitos da sinalização dos receptores de cafeína e adenosina A1 e A2A. No primeiro trabalho, a cafeína (0,3 g / L) foi administrada na água de beber aos filhotes da cepa controle Wistar-Kyoto (WKY) e SHR desde o 8° dia pós-natal (DPN) até o 23° (final da infância). O perfil de ansiedade foi avaliado do 21°ao 23° DPN na arena de campo aberto (CA), labirinto em cruz elevado (LCE) e teste da caixa claro-escuro (CCE), respectivamente. Em relação aos achados comportamentais, enquanto os filhotes da cepa controle (WKY) apresentaram um perfil menos ansioso, os animais SHR de ambos os sexos mostraram comportamento relacionado à ansiedade em todos os testes comportamentais. A hiperlocomoção bem caracterizada nos animais SHR, foi observada em filhotes de ambos os sexos no CA e somente nos machos SHR no LCE e CCE. A cafeína não foi capaz de atenuar a ansiedade e a hiperlocomoção no modelo SHR de ambos os sexos, mas desencadeou ansiedade nas fêmeas da cepa controle WKY. Os resultados obtidos permitiram explorar diferenças sexuais no modelo de TDAH na ansiedade e hiperlocomoção na infância. No segundo trabalho, neurônios corticais cultivados de WKY (linhagem controle) e SHR foram analisados quanto aos parâmetros morfométricos dos neuritos, a imunorreatividade para a proteína tau após o tratamento com a cafeína ou agonistas e antagonistas dos receptores de adenosina A1 e A2A. Além disso, o envolvimento das sinalizações PI3K e PKA também foram avaliados. Nossos resultados demonstraram que os neurônios do modelo de TDAH exibiram menos ramificações, menor comprimento máximo de neuritos e menor densidade de axônios, características de um padrão de crescimento e diferenciação mais atrasado. Os neurônios do modelo do TDAH tratados com cafeína tiveram seu padrão de diferenciação e crescimento somatodendritico recuperado. O agonista do receptor de adenosina A2A (CGS 21680) promoveu maior ramificação dos neuritos por meio da sinalização PKA. O antagonismo seletivo dos receptores de adenosina A2A (SCH 58261), mas não a cafeína, foi eficaz na recuperação do crescimento axonal de neurônios do TDAH via sinalização da PI3K. Nesta tese, foi possível identificar características de comorbidade do TDAH com transtornos de ansiedade e a possibilidade de explorar a ansiedade na infância. Por fim, evidenciamos pela primeira vez, que os neurônios do córtex frontal no modelo do TDAH apresentaram atraso no desenvolvimento e diferenciação, e que a cafeína e os receptores de adenosina A2A podem atuar a nível neuronal, recuperando o crescimento de neurônios. Nossos achados reforçam o potencial da cafeína e dos receptores de adenosina A2A como um tratamento adjuvante para o TDAH.

Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) is one of the most common neuropsychiatric developmental disorders characterized by symptoms of inattention, hyperactivity and impulsivity. ADHD can often be accompanied by comorbid symptoms such as anxiety, which difficult treatment management in children. Although methylphenidate is the first choice of treatment, about 30% of patients will not respond or tolerate it. Therefore, other pharmacological strategies are still necessary for the treatment of ADHD symptoms. Caffeine is the most widely consumed psychostimulant drug worldwide, and its molecular target is the antagonism of adenosine receptors, mainly adenosine A1 and A2A receptors. Caffeine has been beneficial against cognitive impairments observed in an experimental model of ADHD. However, there was no evidence about the effects of caffeine at neuronal level in ADHD and also on the anxiety profile. In this thesis, we sought to find sex differences in the anxiety profile of infant SHR rats, as well as responses to caffeine treatment. In addition, morphological changes were investigated during the development in vitro of frontal cortex neurons from of the most validated animal model for ADHD studies, the Spontaneously hypertensive rats (SHR), as well as the effects of the caffeine and adenosine A1 and A2A receptors signaling. In the first study, caffeine (0.3 g/L, drinking water) was administered to pups WKY (control strain) and SHR, from their dams from postnatal day 8 (PND) to PND 23 (late childhood). Anxiety profile was evaluated from PND 21 to 23 in the open field (OF), elevated plus-maze (EPM) and light dark box test (LDB). Regarding behavioral findings, while animals infant WKY showed less anxiety behavior, SHR from both sexes showed anxiety-related behavior in all behavioral tests. Hyperlocomotion was observed in infant SHR of both sexes in OF, and only in male SHR in EPM and LBD. Caffeine was not able to attenuate anxiety and hyperlocomotion in the SHR model of both sexes, but triggered anxiety in infant females from control strain in the LDB. Our findings allow to explore sex differences in ADHD model in the anxiety and hyperlocomotion in childhood. In the second study, cortical neurons cultured from WKY and SHR were analyzed for neurite morphometric parameters, immunoreactivity for tau protein after treatment with either caffeine or A1R and A2AR agonists or antagonists. Besides, the involvement of PI3K and PKA signaling was also assessed. Our findings revealed that neurons in the ADHD model exhibited delayed outgrowth and differentiation (less branching and shorter maximum neurite length and lower axon density). Caffeine was able to recover neuronal somatodendritic differentiation, via PI3K and PKA signaling. The agonist of the A2A adenosine receptor (CGS 21680) promoted more neurite branching via PKA signaling. The selective A2AR antagonist (SCH 58261), but not caffeine, was efficient in recovering axonal outgrowth from ADHD neurons through PI3K signaling. In this thesis, it was possible to examine features of ADHD comorbid with anxiety disorders and the possibility to explore childhood anxiety. Finally, we showed the first time that cultured frontal cortical neurons from ADHD model presented a clear pattern of impaired differentiation, and and that caffeine and A2A adenosine receptors can act at the neuronal level, recovering the growth of ADHD neurons. Our findings reinforce the potential of caffeine and A2A adenosine receptors as an adjunctive treatment for ADHD.