Desenvolvimento de uma plataforma de biossensioramento com eletrodo a base de nanofios de niobato de sódio para detecção de RNA viral: proposta para aplicação na detecção de SARS-CoV-2

Abstract

A partir de março de 2020 a doença causada pelo vírus SARS-CoV-2 tornou-se um problema de saúde pública e, apesar dos altos índices relatados, existe uma grande subnotificação evidenciando-se a necessidade de tecnologias de diagnóstico de amplo acesso, sensíveis e de baixo custo. Esta tese objetivou a revisão da literatura na área de biossensores eletroquímicos baseados em óxidos de nióbio, além de, considerando o cenário previamente exposto, desenvolver uma plataforma a base nanofios de niobato de sódio com sondas de ácidos nucleicos imobilizadas (genosensor) que possa ser empregada para a identificação de SARS-CoV-2 e que possa ser facilmente adaptada para qualquer outro patógeno. Através do artigo de revisão da literatura, foi possível verificar o potencial de aplicação de óxidos de nióbio como biossensores eletroquímicos, além da importância da nanoestruturação destes óxidos. Para o desenvolvimento da plataforma, foi realizada a construção de 3 tipos distintos de eletrodos suportando a camada de nanofios de niobato de sódio em diferentes coletores de corrente (Nb-NW, FTO-NW e Gf-NW; camada de nanofios de niobato de sódio suportada em bulk de nióbio, vidro condutor e bastão de grafite, respectivamente), metodologias de funcionalização e imobilização de sondas de fitas simples de DNA foram desenvolvidas, além da realização das caracterizações físico-química, morfológica e eletroquímica do dispositivo. Visando a simplificação da construção da plataforma, inicialmente a imobilização por interação eletrostática foi testada, sendo possível a visualização da resposta eletroquímica associada a quantidade de ácido nucleico, porém, foi possível verificar a fraca estabilidade da interação da probe com a superfície do eletrodo. Para ampliar esta estabilidade, a metodologia de funcionalização dos eletrodos foi padronizada recobrindo a superfície dos nanofios com quitosana e glutaraldeído por dip coating, posteriormente imobilizando de forma covalente sondas de DNA modificadas com grupamento amina. Após a confirmação da estabilidade desta imobilização, o bloqueio da superfície foi realizado com BSA (albumina de soro bovino). Todas as etapas de construção foram caracterizadas por ensaios eletroquímicos de VC (voltametria cíclica) e EIE (espectroscopia de impedância eletroquímica), demonstrando que a funcionalização da superfície com quitosana gera diminuição da resistência do sistema, enquanto que a funcionalização com glutaraldeído, a imobilização da probe e o bloqueio dos sítios livres de glutaraldeído geram um aumento da resistência, sempre em comparação com a etapa anterior de construção. Por fim, ensaios de hibridização foram realizados, demonstrando que foi possível detectar o fenômeno de formação dos híbridos constatado pela aparição de nova contante de tempo e aumento dos valeres de resistência total do sistema encontrados por EIE. Entretanto, se faz necessária a otimização das condições para o aumento da seletividade do método. Resultados preliminares indicam a importância do tempo de incubação e da utilização de soluções tampão de hibridização, como SSPE (solução tampão fosfato de sódio salina EDTA) e SSC (solução tampão salina sódio citrato), durante o protocolo de hibridização. Além do artigo de revisão e desenvolvimento metodológico proposto, a partir desta tese também foi possível o pedido de depósito de patente para a proteção intelectual da aplicação e metodologia desenvolvida, além da elaboração de trabalhos complementares abordando a metodologia de retirada da camada de nanofios do bulk para a construção de diferentes configurações de eletrodos e a influência dos componentes do eletrólito na resposta eletroquímica de biossensores.

As of March 2020, the disease caused by SARS-CoV-2 virus has become a public health problem and, despite the high rates reported, there is great underreporting, highlighting the need for widely accessible, sensitive, and low-cost diagnosis technologies. This thesis aimed to review the literature in the area of electrochemical biosensors based on niobium oxides, in addition to, considering the previously exposed scenario, developing a platform based on sodium niobate nanowires with immobilized nucleic acid probes (genosensor) that can be used to the identification of SARS-CoV-2 and that can be easily adapted to any other pathogen. Through the literature review article, it was possible to verify that the application of niobium oxides as electrochemical biosensors is promising, in addition to the importance of the nanostructuring of these oxides in biosensor construction. For the development of the platform, 3 different types of electrodes were fabricated supporting the layer of sodium niobate nanowires in different current collectors (Nb-NW, FTO-NW, and Gf-NW, sodium niobate layer supported on niobium bulk, conductive glass and graphite, respectively), functionalization and immobilization methodologies of single-stranded DNA probes were developed, in addition to physical-chemical, morphological and electrochemical characterizations of the device. Aiming to simplify the construction of the platform, immobilization by electrostatic interaction was initially tested, making it possible to visualize the electrochemical response associated with the amount of nucleic acid, however, it was possible to verify the poor stability of the interaction of the probe with the electrode surface. To increase this stability, the electrode functionalization methodology was standardized by covering the surface of the nanowires with chitosan and glutaraldehyde by dip coating, subsequently covalently immobilizing DNA probes modified with an amine group. After confirming the stability of this immobilization, the surface was blocked with BSA (bovine serum albumin). All construction stages were characterized by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy, demonstrating that surface functionalization with chitosan generates a decrease in system resistance, while functionalization with glutaraldehyde, immobilization of the probe, and glutaraldehyde free-site blocking generate an increase in resistance, always compared to the previous stage of construction. Finally, hybridization tests were carried out, demonstrating that it was possible to detect the phenomenon of hybrid formation as verified by the appearance of a new time constant and an increase in the system's total resistance values found by electrochemical impedance spectroscopy. However, it is necessary to optimize the conditions to increase the selectivity of the method. Preliminary results indicate the importance of incubation time and the use of hybridization buffer solutions, such as SSPE (saline sodium phosphate EDTA buffer) and SSC (saline sodium citrate buffer), during the hybridization protocol. In addition to the review article and proposed methodological development, from this thesis it was also possible to request a patent deposit for the intellectual protection of the application and methodology developed, in addition to the elaboration of complementary works addressing the methodology for removing the nanowire layer from the bulk for the construction of different electrode configurations and the influence of electrolyte components on the electrochemical response of biosensors.