Análise de miRNAs como biomarcadores para câncer de próstata

Abstract

O câncer de próstata (CaP) é o segundo tipo de câncer mais incidente na população masculina mundial. O rastreamento de CaP consiste na determinação sérica do antígeno prostático específico (PSA) e no exame de toque retal (DRE), e o diagnóstico padrão-ouro é a biópsia de próstata. A determinação dos níveis de PSA não é uma abordagem com alta especificidade. Para evitar o sobrediagnóstico e sobretratamento de pacientes com CaP, é necessário validar novos biomarcadores mais sensíveis e específicos para a doença. Nesse aspecto, os miRNAs têm sido amplamente estudados como possíveis biomarcadores para diversos tipos de câncer, incluindo o CaP. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão de miRNAs em tecido prostático e sangue em amostras de pacientes com CaP e pacientes com hiperplasia prostática benigna (HPB). Foram coletadas amostras de tecido prostático e sangue de 66 pacientes submetidos à cirurgia de próstata, sendo 33 diagnosticados com CaP e 33 com HPB. A extração de RNA foi realizada de forma automatizada com o kit comercial MagMAX™ mirVana™ Total RNA Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, EUA) e, nesta etapa, foi adicionado uma solução de RNA exógeno (cel-miR-39) para servir como controle de todas as etapas dos experimentos. A conversão do RNA e síntese de cDNA foi feita com o TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, EUA). As qPCRs foram realizadas no termociclador StepOne Plus (Thermo Fisher Scientific, EUA), empregando-se os reagentes TaqMan Fast Advanced Master Mix e TaqMan Advanced miRNAs Assays (Thermo Fisher Scientific, EUA). As expressões relativas dos miRNAs foram calculadas utilizando o método 2-ΔΔCq. Para esse cálculo, foi utilizado como controle um miRNA endógeno e expresso de forma estável entre os grupos analisados. Além disso, foi preparada uma amostra calibradora para cada tipo de tecido biológico, contendo um pool de RNAs de pacientes de ambos os grupos analisados. Para investigar o poder discriminatório dos miRNAs entre os grupos, foram geradas curvas ROC (receiver-operating characteristic) e calculadas as áreas sob as curvas (areas under the curves – AUC). Para avaliar o poder discriminatório da combinação dos alvos, foram realizadas análises de regressão logística. No plasma, apenas o miR-375-3p demonstrou maior expressão no grupo CaP em comparação ao grupo HPB. No tecido prostático, os três miRNAs analisados estavam significativamente mais expressos no CaP do que na HPB. Apesar da ampla utilização do PSA sérico no rastreamento e monitoramento do CaP, na amostragem deste estudo, a utilização do miRNA plasmático 375-3p, e dos miRNAs teciduais 375-3p, 21-5p e 200b-3p, de forma individual ou combinada, permitiram uma melhor diferenciação entre os pacientes com CaP e os pacientes com HPB do que a utilização única do PSA sérico. A partir dos resultados deste trabalho, podemos sugerir o miR-375-3p como um possível biomarcador não-invasivo para o diagnóstico e manejo do câncer de próstata.

Prostate cancer (PCa) is the second most incident cancer in the male population worldwide. PCa screening involves the measurement of prostate-specific antigen (PSA) levels in the blood and digital rectal examination (DRE), with the gold standard for diagnosis being prostate biopsy. PSA level determination lacks high specificity. To prevent overdiagnosis and overtreatment of PCa patients, it is essential to validate new biomarkers that are more sensitive and specific to this disease. In this context, microRNAs (miRNAs) have been extensively studied as potential biomarkers to multiple types of cancer, including PCa. The aim of this study was to evaluate the expression of miRNAs in prostate tissue and blood in samples from patients with PCa and patients with benign prostatic hyperplasia (BPH). Prostate tissue and blood samples were collected from 66 patients undergoing prostate surgery, 33 diagnosed with PCa and 33 with BPH. RNA extraction was performed using the MagMAX™ mirVana™ Total RNA Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, USA), with the addition of an exogenous RNA solution (cel-miR-39), to serve as a control for all experimental steps. RNA conversion and cDNA synthesis were carried out using the TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). qPCRs were conducted on the StepOne thermocycler (Thermo Fisher Scientific, USA), using TaqMan Fast Advanced Master Mix and TaqMan Advanced miRNAs Assays (Thermo Fisher Scientific, USA). Relative miRNA expressions were calculated using the 2-ΔΔCq method, with an endogenous miRNA stably expressed across the analyzed groups as a control. Additionally, a calibrator sample was prepared for each biological specimen, containing a pool of RNAs from patients from both analyzed groups. To investigate the discriminatory potential of miRNAs between the analyzed groups, receiver-operating characteristic (ROC) curves were generated, and areas under the curves (AUCs) were calculated. Logistic regression analyses were performed to assess the discriminatory potencial of target combinations. In plasma, only miR-375-3p showed significant overexpression in the PCa group compared to the BPH group. In prostate tissue, all three analyzed miRNAs were significantly overexpressed in PCa. Despite the widespread use of serum PSA in PCa screening and monitoring, in this study, the use of plasma miRNA-375-3p and tissue miRNAs 375-3p, 21-5p, and 200b-3p, either individually or combined, performed better differentiation between PCa and BPH patients than the use of serum PSA. Based on the results of this study, miR-375-3p is suggested as a potential non-invasive biomarker for the diagnosis and management of prostate cancer.