Efeitos da isquemia cerebral transitória sobre proteínas do citoesqueleto de hipocampo de ratos

Abstract

A isquemia cerebral é caracterizada por uma redução severa ou por um completo bloqueio do fluxo sanguíneo ao cérebro. Sabe-se que este insulto causa um aumento dos níveis intracelulares de cálcio, desencadeando numerosos processos bioquímicos, em particular a ativação de proteases dependentes de cálcio como a calpaína. Sabe-se também que as subunidades constituintes dos neurofilamentos (NF-H,NF-M,NF-L) são muito sensíveis à ação da calpaína. O modelo experimental utilizado para induzir isquemia em ratos foi o método de oclusão dos quatro vasos. Este método consiste na obstrução, por eletrocoagulação, das artérias vertebrais e, após 24 horas, a oclusão das artérias carótidas comuns por ajustamento de fios de silicone, durante 20 minutos. Ao final da isquemia, os animais foram sacrificados em diferentes tempos de reperfusão: 0(imediato), 1,2,3, 7, 10 e 15 dias. Neste trabalho estimamos, ao longo dos diferentes tempos de reperfusão, a concentração das subunidades dos neurofilamentos (NF-H,NF-M,NF-L) e dos filamentos gliais (GFAP), bem como a incorporação in vitro de 32P em proteínas do citoesqueleto. Além disso, foi feito o estudo da incorporação in vitro de 14C-leucina nas proteínas da fração FI. Para a análise quantitativa e da incorporação in vitro de 14C-leucina, foi utilizada a fração enriquecida em filamentos intermediários (fração FI), que é extraída em tampão de alta força iônica, na presença de Triton X-100. A fração FI foi quantificada, analisada por SDS-PAGE 10% e as subunidades dos filamentos intermediários foram quantificadas por densitometria. Os resultados obtidos demonstraram que a isquemia cerebral transitória causou uma diminuição na concentração das subunidades dos filamentos intermediários presentes na fração FI até o 2° dia de reperfusão. Como não se detectou diminuição na síntese de proteínas totais da fração FI neste intervalo, é provável que a diminuição da concentração das subunidades dos filamentos intermediários não seja causada por uma diminuição de síntese. O estudo da incorporação in vitro de 32P nas proteínas citoesqueléticas teve o objetivo de verificar se o estado de fosforilação destas proteínas poderia estar relacionado à provável degradação sofrida pelas mesmas. Para a análise da incorporação de 32P in vitro, foi utilizada a fração citoesquelética, obtida por extração na presença de Triton X-100. A isquemia cerebral transitória causou uma diminuição da incorporação ín vitro de 32P na NF-M e NF-L até o 1° dia de reperfusão, sendo que os valores retornaram aos níveis do controle a partir do 2° dia. Sugerimos que a diminuição da fosforilação tenha tornado estas subunidades mais suscetíveis à proteólise dependente de cálcio. A recuperação parcial da concentração das subunidades dos filamentos intermediários após o 3° dia de reperfusão foi acompanhada pela recuperação da fosforilação e pelo aumento da incorporação in vitro de 14C-leucina nas proteínas do citoesqueleto. Possivelmente, a capacidade de recuperação apresentada é proveniente das células hipocampais que sobreviveram ao insulto isquêmico, sugerindo mecanismos regulatórios distintos nos diferentes setores do hipocampo.