Avaliação de sistema purinérgico em ratos submetidos a estresse crônico : interações farmacológicas e bioquímicas

Abstract

Diferentes efeitos têm sido observados sobre a resposta nociceptiva após a exposição a estresse agudo ou crônico em ratos. A exposição a estresse agudo induz analgesia e a estresse crônico, hiperalgesia. O sistema purinérgico é sabidamente envolvido em mecanismos de nocicepção (ativando ou inibindo). Nessa tese, avaliaram-se a nocicepção em ratos estressados cronicamente por imobilização e alguns parâmetros a ela relacionados. Além disso, avaliou-se a hidrólise de nucleotídeos de adenina em diferente estruturas do SNC (medula espinhal, córtex cerebral, hipotálamo) e soro. Ratos Wistar adultos foram repetidamente estressados por 40 dias, o que induziu hiperalgesia, observada no aparelho de tail-flick. A hiperalgesia observada em machos após estresse crônico é dependente de gênero, uma vez que não ocorreu em fêmeas. Nova sessão de estresse agudo foi aplicada após os 40 dias de estresse, observando-se analgesia após a sessão de nado forçado, mas não após imobilização. Avaliou-se também o efeito de agonista de receptor A1 de adenosina, N6-ciclopentiladenosina (CPA, 3,35 mg/kg, por via i.p.) e de um antagonista de receptor A1 de adenosina, 1,3-dipropil-8- ciclopentilxantina (DPCPX, 0,8 mg/kg, por via i.p.), assim como o efeito de um inibidor de transporte de nucleosídeos, dipiridamol (DP, 5 mg/kg, por via i.p.), na nocicepção de animais controles e cronicamente estressados. O grupo controle apresentou aumento da latência de tail-flick após a administração de CPA e DP, mas nenhum efeito foi observado no grupo cronicamente estressado. DPCPX não produziu alteração de nocicepção em quaisquer dos grupos. Os efeitos analgésicos de CPA e DP foram revertidos por DPCPX nos animais controle, indicando envolvimento de adenosina e, mais especificamente, de receptores A 1 de adenosina na antinocicepção observada. A ausência de efeito em animais estressados sugere que a sinalização da dor induzida por estresse crônico apresenta uma modulação diferente, envolvendo o sistema adenosinérgico. Uma NTPDase (apirase) hidrolisa ATP e ADP em sinaptossomas de sistemas nervosos central e periférico. Considerando os resultados farmacológicos obtidos com agonistas e antagonistas de receptores de adenosina, investigou-se a hidrólise de nucleotídeos de adenina em medula espinhal de ratos machos e fêmeas estressados crônica e agudamente. Ratos Wistar adultos machos e fêmeas foram submetidos a 1 h/dia a estresse por imobilização por 1 dia (agudo) ou por 40 dias (crônico), foram sacrificados 24 horas após a última sessão de estresse. Atividades ATPásica-ADPásica foram medidas em sinaptossomas de medula espinhal de ratos controles e estressados. A hidrólise do ADP mostrou-se diminuída em 25% nos animais machos cronicamente estressados. Houve também neste grupo aumento na atividade da S'nucleotidase, enzima que hidrolisa AMP extracelular. Nenhum efeito foi observado em fêmeas cronicamente estressadas ou em estresse agudo tanto em machos quanto em fêmeas. Avaliou-se então a hidrólise de nucleotídeos de adenina em sinaptossomas de duas estruturas cerebrais ( córtex frontal e hipotálamo) e soro de ratos machos. Não foi observada qualquer alteração de atividades ATPásica ou ADPásica após estresse crônico nas estruturas cerebrais analisadas. Por outro lado, houve redução de 27% na hidrólise do ADP, sem alteração na atividade ATPásica em soro dos animais cronicamente estressados. É possível que esse efeito represente uma adaptação ao estresse crônico, podendo refletir diferentes funções de nucleotídeos e/ou enzimas nessas frações. Além disso, também é possível que níveis alterados da atividade ADPásica no soro possa servir como marcador bioquímico de estresse. Aumento da concentração de ADP, sabidamente um indutor de agregação plaquetária, em soro pode sugerir um papel para esse fator na etiologia da arterosclerose produzida por estresse. Investigou-se então o efeito do estresse agudo na hidrólise de nucleotídeos de adenina em soro de ratos, utilizando diferentes tempos de avaliação após a sessão de estresse. Ratos adultos machos foram submetidos a 1 hora de estresse de imobilização e foram mortos após O, 6, 24 e 48 horas. Houve aumento da hidrólise de ATP e ADP 24 horas após o estresse (58% e 54% respectivamente, quando comparado ao grupo controle). Por outro lado, a hidrólise de AMP aumentou 6 e 24 horas (68% e 94% respectivamente, em comparação ao controle) após o estresse. Esses efeitos podem refletir a presença de mecanismo de proteção ao estresse e as alterações enzimáticas observadas em soro podem ser marcadores bioquímicos de exposição aguda a um estressor.

Different effects upon the nociceptive response have been observed with exposure to acute and chronic stress in rats. The acute stress has induced analgesia, and, in the other hand, the chronic stress has induced hiperalgesia. The purinergic system is involved in the nociception mechanisms. ln this thesis, we aimed to study nociception in chronically stressed rats and to evaluate some parameters related to nociception in these animals. ln addition we evaluated the nucleotides hydrolysis in different fractions (spinal cord, cerebral cortex, hypothalamus and blood serum). Adult Wistar rats were repeatedly submitted to restraint for 40 days, and the nociceptive response was evaluated using the tail-flick test. The effect hiperalgesic observed in the male rats is gender-dependent. Exposuring the animals to a new session of acute stress at the end of 40 days period, the chronically-stressed rats demonstrated analgesia after forced swimming, but not after restraint. We also evaluated the effects of adenosine A 1 receptor agonist, N6-cyclopentyladenosine (CPA, 3.35 mg/kg, i.p.), and adenosine A1 receptor antagonist, 1,3-dipropyl-Bcyclopentylxanthine (DPCPX, 0.8 mg/kg, i.p.), as we/1 the effect of nucleosides transport inhibitor, dipyridamole (DP, 5 mg/kg, i.p.), upon nociception in chronically stressed and control rats. The control group showed increased tail-flick latencies after administration of CPA and DP, but this effect was not observed in the stressed group. DPCPX did not produce analgesic effect in neither groups. The analgesic effect of CPA was reverted by DPCPX and dipyridamole in the control animals. These results indicate the involvement of adenosine and adenosine A 1 receptor in the antinociception observed in the control group and suggest that the pain signaling induced by chronic stress presents a different modulation involving the adenosinergic system. No effect was observed in females. There is increasing evidence that both ATP and adenosine can modulate pain. NTPDase (apyrase) hydrolyze extracellular ATP and ADP in synaptosomes from the peripheral and central nervous system. Considering to the pharmacological effects observed before, we investigated the effect of chronic and acute stress on ATPase-ADPase and 5' nucleotidase activities in spinal cord of male and female rats. Adult male and female Wistar rats were submitted to 1 h/day restraint stress for 1 day (acute) or 40 days (chronic) and were sacrificed 24 h later. ATPase-ADPase activities were assayed in the synaptosomal fraction obtained from the spinal cord of control and stressed animals. ADP hydrolysis was decreased 25% in chronically stressed males, while no change was observed on ATPase activity. There was an increase in the 5'nucleotidase activity, an enzyme that hydrolyze extracellular AMP, in the same group. No effect on ADPase, ATPase and 5'nucleotidase activity was observed in chronically stressed females, and after acute stress neither in males or females. ln addition, we evaluated the effect of chronic stress on the hydrolysis of adenine nucleotides in two cerebral structures (frontal cortex and hypothalamus) and in the blood serum of male rats. No effect on ADPase or ATPase activities was observed in synaptosomal fraction of any of the cerebral structures analyzed after chronic stress. On the other hand, ADP hydrolysis was decreased 27% in chronically stressed males, while no change was observed on ATPase activity. lt is also possible that the effects observed in blood serum may represent an adaptation to chronic stress and may reflect different functions of nucleotides and/or enzymes in these fractions. lt is possible that altered levels of ADPase activity in serum may be a biochemical marker for chronic stress situations. The increased ADP concentration in the serum of chronically stressed animals may suggest the role of this factor in the etiology of atherosclerosis, since ADP is known as platelet aggregation inductor. Thus, we investigated the effect of acute stress on the hydrolysis of adenine nucleotides in rat blood serum. Adult male Wistar rats were submitted to 1 h restraint stress and were sacrificed at 0, 6, 24 and 48 h. Increased ATP and ADP hydrolysis was observed in the blood serum of stressed rats 24 h after the stress session (58% and 54 % respectively when compared to controls). On the other hand, the AMP hydrolysis was increased after 6 h and 24 h (68% and 94% respectively when compared to controls) after stress. These effects may represent a protective mechanism against the effects of stress and the altered activity of soluble enzymes in serum may be a biochemical marker for acute stress situations.