Morte neuronal e neuroproteção em culturas de neurônios corticais : a importância da interação neurônio-astrócito

Abstract

Fatores neurotróficos secretados por astrócitos prolongam a sobrevivência e promovem o crescimento neuronal in vitro. Efeito semelhante é obtido pela despolarização com elevadas concentrações de K+ numa variedade de tipos neuronais. Entretanto, os astrócitos também podem secretar agentes neurotóxicos. Uma das formas de provocar este tipo de reação é através da adição de LPS, que induz a expressão da enzima NOS além da secreção de citocinas pró-inflamatórias. Nosso objetivo foi investigar a morte e a neuroproteção de neurônios corticais, com especial enfoque para a interação entre estas células nervosas e os astrócitos. Para tanto, estudamos o efeito da estimulação de astrócitos com LPS na tentativa de verificar se a mesma desencadearia neurotoxicidade. Por outro lado, para estudar a neuroproteção, propomos um modelo de injúria neuronal por insuficiência de fatores tróficos, no qual testamos o efeito de elevadas concentrações de K+ e o bloqueio de canais de K+ do tipo IA. Na preparação das culturas primárias de neurônios corticais, utilizamos embriões com 16 dias de gestação e, para as de astrócitos, neonatos com no máximo 24 h, pertencentes a cepa Sprague-Dawley. Em nosso estudo sobre neurotoxicidade, empregamos o ionóforo de Ca2+ A23187 em culturas puras de neurônios corticais. Nestes casos, as concentrações neurotóxicas promoveram morte com características necróticas. Em outro paradigma, a substituição do meio de cultura demonstrou ser um eficiente promotor de dano neuronal. Observamos que este tipo de procedimento desencadeia um mecanismo excitotóxico mediado por receptores NMDA, dependente da idade da cultura, e um outro relacionado com a restrição de fatores tróficos que independe desta situação. Além disso, verificamos que o meio condicionado e as elevadas concentrações de K+ apresentam significativos efeitos neuroprotetores contra a injúria provocada por trocas de meio e que a adição de DTX e 4-AP mimetiza esta ação trófica atuando através de canais de Ca2+ voltagem-dependentes do tipo L, sensíveis a nifedipina. Por outro lado, a LPS não diminuiu a viabilidade de células PC12 indiferenciadas ou neuronais quando estas encontravam-se em co-cultura com astrócitos e também não provocou neurotoxicidade em culturas de neurônios corticais puras, mistas ou co-culturas. Entretanto, o meio condicionado por monocamadas secundárias de astrócitos previamente estimuladas com a endotoxina, exerceu um efeito neurotóxico quando utilizado em culturas corticais puras. Desta forma, as monocamadas estimuladas parecem ter liberado um fator difusível cujo efeito só foi observado em culturas neuronais puras, parecendo depender da interação neurônio-astrócito, pois em co-cultura não foram observados danos neuronais. A atividade NOS destas culturas secundárias que condicionaram o meio, foi avaliada pela quantificação dos níveis de NO2- acumulados no meio, através da técnica de Griess e pela demonstração da atividade NADPH-diaforase. Não obtivemos evidências da participação da via nitridérgica, restando para ser estudada uma provável resposta inflamatória mediada por citocinas liberadas pelos astrócitos. Assim, observamos que os astrócitos corticais podem secretar no meio de cultura tanto fatores neurotóxicos quanto neuroprotetores. Demonstramos também, que as correntes de K+ do tipo IA podem ter um papel na sobrevivência de neurônios corticais embrionários.

Neurotrophic factors produced by astrocytes increase the survival and promete in vitro neuronal outgrowth. A similar effect is obtained by depolarization with high K+ concentrations in many neuronal types. However, astrocytes may also release neurotoxic factors. When stimulated with LPS, NOS is induced in these cells and pro-inflammatory cytokines are released. We decided to investigate death and neuroprotection of cultured cortical neurons, with special interest in the neuron-astrocyte interaction. We studied the effect of LPS-astrocyte stimulation attempting to verify whether this procedure would promote neurotoxicity. ln order to assess neuroprotection we used a model of neuronal injury by trophic deprivation, in which we tested the effect of high K+ concentrations and the blockade of IA K+ channels on neuronal survival. Primary astrocyte cultures were prepared from 1-day-old Sprague-Dawley rats, and the cortical neurons were obtained from 16-day-old embryos. ln order to study the neurotoxicity, we employed Ca2+ ionophore A23187 in pure cortical neuron cultures. ln such condition, neurotoxic concentrations promote death with necrotic characteristics. ln another paradigm, the replacement of culture medium showed to be an efficient promoter of neuronal damage. We observed that this procedure leads both to an excitotoxic mechanism mediated by NMDA receptors, dependent on the age of culture, and to another related to trophic factors restriction that is independent on the culture age. Furthermore, we verified that conditioned medium and high K+ concentrations exerted neuroprotection against medium changes associated injury. The addition of DTX or 4-AP, acting through L type voltage-dependent Ca2+ channels sensitive to nifedipine, mimics the trophic action of conditioned medium. On the other hand, LPS did not diminish the viability of indiferentiated or neuronal PC12 cells when these cells were co-cultured with astrocytes. The endotoxin also lacked neutotoxicity in pure cortical neuronal cultures and co-cultures. However, the conditioned medium from secondary astrocyte monolayers pre-stimulated with LPS had a neurotoxic effect on pure cortical cultures. This suggests that stimulated monolayers release a difusible factor which affects neurones in culture and that such effect probably depends of neuron-astrocyte interaction. NOS activity in secondary cultures used to condition the medium was determined by quantification of NO2 • accumulated leveis in the medium, through Griess technique and by NADPH-diaphorase activity. We had no evidence of nitridergic pathway participation. Concluding, we reported that cortical astrocytes can release both neurotrophic and neurotoxic factors to the medium, and that IA type-K+ currents might have a role on survival of embryonic cortical neurons.