Ectonucleotidases e plasticidade sináptica : papel das enzimas de degradação de nucleotídeos extracelulares na memória e em modelos animais de epilepsia

Abstract

Várias evidências sugerem o papel do ATP extracelular na plasticidade sináptica. O ATP pode induzir potenciação de longa duração (LTP) e sua participação na fosforilação de proteínas extracelulares é considerada um sinal para mudanças de longa-duração na atividade sináptica. O ATP evoca respostas através de dois subtipos de receptores P2, P2X e P2Y. As ações sinalizadoras induzidas pelo ATP extracelular podem estar correlacionadas à atividade de um grupo de ectoenzimas, as ectonucleotidases, que promovem a conversão enzimática de ATP, controlando os níveis do nucleotídeo na fenda sináptica. O neurotransmissor ATP pode ser hidrolisado até adenosina, um neuromodulator importante, pela ação conjugada deste grupo de ectonucleotidases, do qual fazem parte uma ecto-ATPase (EC 3.6.1.3), uma ATP difosfoidrolase (apirase, EC 3.6.1.5) e uma 5'nucleotidase (EC 3.1.3.5). O controle dos níveis de ATP e adenosina promovido pelas ectonucleotidases pode ser importante para a modulação dos mecanismos relacionados à plasticidade sináptica. Nossos resultados demonstraram que as atividades ectonucleotidásicas são moduladas em situações :fisiológicas e patológicas capazes de induzir plasticidade sináptica, tais como memória e epilepsia. A ATP difosfoidrolase e a 5'-nucleotidase de sinaptossomas de hipocampo apresentam-se inibidas imediatamente após sessão de treino na tarefa de esquiva inibitória em ratos. Além disso, uma diminuição significativa na hidrólise do ATP foi também observada 30 minutos após a sessão de treino na tarefa. As atividades enzimáticas estudadas não demonstraram diferenças significativas após a sessão de teste na tarefa de esquiva inibitória. Nossos resultados indicaram que a modulação das atividades ectonucleotidásicas pode participar nos mecanismos de aquisição da memória, mas não tem efeito na evocação. Além disso, é possível sugerir a participação das ectonucleotidases na fase da consolidação da memória, desde que uma inibição da ATP difosfoidrolase foi observada 180 minutos pós-treino. Determinou-se também estas atividades em outras estruturas cerebrais envolvidas na formação da memória, como córtex entorrinal e córtex parietal. Nossos resultados mostraram uma inibição da ATP difosfoidrolase em córtex entorrinal de ratos imediatamente, mas não 180 e 360 min após a sessão de treino. As alterações observadas em hipocampo e córtex entorrinal poderiam representar um mecanismo bioquímico importante relacionado à aquisição da memória. Ectonucleotidases de córtex parietal não demonstraram mudanças significativas, sugerindo que estas enzimas não são relevantes para a formação da memória de esquiva inibitória em córtex parietal. Para investigar o envolvimento do sistema purinérgico nesta condição, nós analisamos o efeito da suramina na retenção da tarefa de esquiva inibitória. Além de ser um antagonista de receptores de P2 e NMDA, nossos resultados demonstraram que a suramina é um inibidor não-competitivo da apirase, com valores de Ki na faixa de micromolar. A infusão intra-hipocampal de suramina imediatamente pós-treino reduziu a retenção da tarefa em um efeito dose-dependente. O efeito amnésico é provavelmente devido à sua ação antagonista em receptores P2 e NMDA. Considerando que a adenosina tem potentes efeitos anti-convulsivantes, nós determinamos as atividades ectonucleotidásicas após a indução de epilepsia por vários modelos animais, como os modelos da pilocarpina, ácido caínico e kindling. As atividades da ATP difosfoidrolase e 5'-nucleotidase de sinaptossomas de hipocampo e córtex cerebral de ratos aumentaram significativamente 48-52 horas, 7-9 dias e 45-50 dias após a indução do estado epiléptico (EE) por pilocarpina ou pelo modelo do ácido caínico. Porém, somente a atividade da 5'nucleotidase permaneceu elevada 100-110 dias após o tratamento com ácido caínico. A regulação da via das ectonucleotidases pode desempenhar um papel modulatório durante a evolução das mudanças comportamentais e patofisiológicas induzidas pelo EE. Não foram observadas mudanças nas atividades ectonucleotidásicas em diferentes períodos de tempo após uma única injeção convulsivante de pentilenotetrazol (PTZ). Porém, ratos com maior resistência ao kindling induzido por PTZ apresentaram um aumento na hidrólise do ATP em sinaptossomas de hipocampo e córtex cerebral. Estas mudanças podem representar um mecanismo importante na modulação da atividade epiléptica crônica. A demonstração de que as ectonucleotidases apresentaram as atividades diferentemente alteradas após a aquisição de uma tarefa de memória ou após a indução de epilepsia por diferentes modelos animais, sugere que estas enzimas podem agir na regulação da atividade sináptica, controlando os níveis de ATP e adenosina, de acordo com a plasticidade sináptica desenvolvida, em situações fisiológicas ou patológicas.

Several evidences suggest a role of extracellular ATP in the synaptic plasticity. ATP is able to induce long-term potentiation (LTP) and its participation in extracellular protein phosphorylation has been suggested as a signal for long-lasting changes in synaptic activity. ATP evokes responses through two subclasses of P2-purinoceptors, P2X and P2Y. The signaling actions induced by extracellular ATP are directly correlated to the activity of a group of ectoenzymes, ectonucleotidases, which trigger enzymatic conversion of ATP, controlling the nucleotide leveis in the synaptic cleft. The neurotransmitter ATP can be hydrolyzed to adenosine, an important neuromodulator, by the conjugated action of this group of ectonucleotidases, that includes an ecto-ATPase (EC 3.6.1.3), an ATP diphosphohydrolase (apyrase, EC 3.6.1.5) and a 5'nucleotidase (EC 3.1.3.5).The control of ATP and adenosine levels promoted by ectonucleotidases can be important to the modulation of the mechanisms related to synaptic plasticity. Our results showed that ectonucleotidases activities are modulated in physiological and pathological situations able to induce synaptic plasticity, such as memory and epilepsy. ATP diphosphohydrolase and 5' - nucleotidase activities from hippocampal synaptosomes were inhibited immediately after the training session in a step-down inhibitory avoidance task in rats. Furthermore, a significant decrease of ATP hydrolysis was observed 30 minutes after the training session. The enzyme activities studied did not present significant changes after test session of the task. Our results indicated that the modulation of ectonucleotidase activities can participate in the mechanisms of memory acquisition, but has no effect on retrieval. Furthermore, it is possible to suggest the participation of ectonucleotidases in the consolidation phase of memory, since an inhibition of ATP diphosphohydrolase activity was observed at 180 minutes post-training. We also determined these activities in other brain structures involved in memory formation, such as entorhinal cortex and parietal cortex. Our results showed an inhibition of ATP diphosphohydrolase in entorhinal cortex of rats immediately, but not at 180 and 360 min after training session. The alterations observed in hippocampus and entorhinal cortex could represent an important biochemical mechanism related to memory acquisition. Ectonucleotidases from parietal cortex did not show significant changes, suggesting that these enzymes are not relevant to formation of inhibitory avoidance memory in parietal cortex. ln order to investigate the involvement of purinergic system in this condition, we investigate the effect of suramin on the retention of step-down inhibitory avoidance task. Besides to be an antagonist of P2 and NMDA receptors, our results showed that suramin is a non-competitive inhibitor of apyrase activity, with Ki values in the range of micromolar. lntrahippocampal infusion of suramin immediately post-training reduced the retention of the task in a dose-dependent effect. The amnesic effect is probably due its antagonist action on P2 and NMDA receptors. Considering that adenosine has potent anticonvulsant effects, we determined ectonucleotidase activities after the induction of epilepsy by several animal models, such as pilocarpine, kainic acid and kindling models. ATP diphosphohydrolase and 5'nucleotidase activities from synaptosomes of hippocampus and cerebral cortex of rats significantly increased at 48-52 hours, 7-9 days and 45-50 days after induction of status epilepticus (SE) by pilocarpine or kainic acid models. However, only 5' -nucleotidase activity remains elevated at 100- 110 days after the treatment with kainic acid. The regulation of ectonucletidase pathway may play a modulatory role during the evolution of behavioral and patophysiological changes induced by status epilepticus. Changes in ectonucleotidase activities were not seen at different times after a single convulsant pentylenetetrazol (PTZ) injection. However, in PTZ kindling, rats showing greater resistance to the kindling presented an increase in ATP hydrolysis in synaptosomes from hippocampus and cerebral cortex. These changes may represent an important mechanism in the modulation of chronic epileptic activity. The demonstration that ectonucleotidases presented the activities differently altered after the acquisition of a memory task or after the induction of different animal models of epilepsy, suggest that these enzymes can act in the regulation of synaptic activity, controlling ATP and adenosine levels, according the synaptic plasticity developed, in physiological or pathological situations.