Estudo de novos componentes da via de sinalização mediada por cálcio e calcineurina em Cryptococcus neoformans

Abstract

Cryptococcus neoformans é uma levedura basidiomicética, principal agente etiológico da criptococose em humanos. A forma mais grave desta doença, denominada meningoencefalite criptocócica, tem incidência global de 220.000 casos e causa aproximadamente 181.000 mortes anualmente. A via de sinalização mediada por cálcio e calcineurina tem papel essencial na adaptação criptocócica às condições encontradas no hospedeiro durante o desenvolvimento da doença. O objetivo deste trabalho foi explorar esta via de sinalização em busca de novos possíveis componentes que impactam a virulência de C. neoformans. Inicialmente, realizamos uma análise in silico de dados brutos transcritômicos de RNA-seq relacionados a três mutantes nulos para produtos gênicos chave desta via: fosfatase calcineurina, fator de transcrição Crz1, e transportador de cálcio Pmc1. Após uma análise integrada de redes de interação entre os genes diferencialmente expressos por biologia de sistemas, selecionamos CNAG_00522 como um novo potencial membro da via cálcio-calcineurina. Este gene é comum às redes geradas para os mutantes pmc1Δ e cna1Δ, e é regulado positivamente por esses componentes. Buscas por domínios conservados revelaram a presença de um domínio relacionado a C2B_Tricalbin, o qual tem conexão a módulos de direcionamento de membrana dependentes de Ca2+ que ligam diferentes moléculas, como fosfolipídios, polifosfatos de inositol e proteínas intracelulares. No intuito de aprofundar a caracterização funcional de CNAG_00522, avaliamos os níveis de transcritos deste gene por RT-qPCR em amostras de cDNA de C. neoformans obtidas de linhagens selvagem (WT) e mutantes (pmc1Δ e crz1Δ) cultivadas em diferentes condições de temperatura e presença e ausência de cálcio. Observamos que a expressão de CNAG_00522 é regulada positivamente a 37oC, e o fator de transcrição Crz1 é um potencial regulador negativo da expressão deste gene. Análises funcionais baseadas na deleção de CNAG_00522 devem ser conduzidas no intuito de confirmar a participação deste gene na via de sinalização mediada por cálcio e calcineurina, assim como avaliar o papel deste componente na virulência de C. neoformans.

Cryptococcus neoformans is a basidiomycetous yeast and the main etiological agent of cryptococcosis in humans. The most severe form of this disease, called cryptococcal meningoencephalitis, has a global incidence of 220,000 cases and causes approximately 181,000 deaths annually. The calcium and calcineurin- mediated signaling pathway plays an essential role in cryptococcal adaptation to host conditions during disease development. The aim of this work was to explore this signaling pathway to search for new possible components that impact the virulence of C. neoformans. Initially, we performed an in silico analysis of RNA-seq transcriptomic data related to three null mutants for key gene products of this pathway: calcineurin phosphatase, Crz1 transcription factor, and Pmc1 calcium transporter. After an integrated analysis of interaction networks between genes differentially expressed using systems biology, we selected CNAG_00522 as a new potential member of the calcium-calcineurin pathway. This gene is common to the networks generated for the pmc1Δ and cna1Δ mutants, and it is positively regulated by these components. Analysis of conserved domains in the primary sequence of this protein revealed the presence of a C2B_Tricalbin related domain, which is associated with Ca2+ dependent membrane targeting modules that bind to different molecules, such as phospholipids, inositol polyphosphates and intracellular proteins. In order to further characterize the CNAG_00522 gene, we evaluated its transcript levels by RT-qPCR in C. neoformans cDNA samples obtained from wild (WT) and mutant strains (pmc1Δ and crz1Δ) grown under different conditions of temperature and in the presence and absence of calcium. We observed that CNAG_00522 expression is positively regulated at 37oC, and that the transcription factor Crz1 is a potential negative regulator of the expression of this gene. Functional analysis based on the CNAG_00522 deletion should be conducted in order to confirm the participation of this gene in the signaling pathway mediated by calcium and calcineurin, as well as to evaluate the role of this component in the virulence of C. neoformans.