Análise genômica e transcriptômica das rotas Argonauta e Piwi em Stenostomum leucops

Abstract

O gênero Stenostomum é composto por microturbelários de vida livre pertencentes a classe Catenulida, sendo este o grupo mais basal dos Platyhelminthes, são cosmopolitas, distribuídos globalmente. A maioria das espécies se reproduz assexuadamente por paratomia pela formação de zooides, novos vermes crescem a partir da extremidade posterior do animal, podendo formar uma cadeia de indivíduos. Esses animais podem ser apontados como potenciais organismos modelos devido a fácil manutenção em laboratório principalmente por apresentarem reprodu- ção assexuada e grande capacidade regenerativa. Os microRNAs são pequenos RNAs não co- dificantes que têm importantes funções na regulação gênica. Podem ser divididos em dois gru- pos dependo com a proteína com que interagem: siRNAS que interagem com Argonauta, silen- ciam gene-alvos em níveis transcricionais e pós-transcricionais; e piRNAs que interagem com as proteínas da família Piwi, que protegem o genoma da atividade mutacional dos elementos transponíveis na linhagem germinativa em animais. Os microRNAs podem influenciar de dife- rentes formas durante o processo de regeneração em planárias e na manutenção da do estado de totipotência celular. Desta forma, uma análise detalhada da composição genômica, em Stenos- temum leucops, dos genes das famílias Argonauta e Piwi, podem contribuir para o entendimento do papel dos miRNA no estado de totipotência celular dos Platyhelminthes e se esta caracterís- tica já estava presente no grupo mais basal. Para o estudo foram obtidas sequências de proteínas Argonauta e Piwi de outros organismos do grupo de Platyhelminthes e grupos externos, para comparação com de S. leucops, essas foram obtidas através da revisão de literatura e bases de dados online (WormBase Parasite, NCBI e FlyBase). Os genomas e transcriptomas de S.leucops foram sequenciados pelo nosso grupo, o genoma através de long-reads (Nanopore) e short- reads(Ilumina). O transcriptoma para um e dois zooides (Iontorrent S5). Para predição dos genes foiutilizado software Augustus, com treinamento das respectivas sequências de proteínas para pos-terior localização no genoma de S.leucops. As sequências encontradas foram ainda anotadas manualmente utilizando o software Ugene e funcionalmente com eggNOG mapper. Para a iden-tificação de domínios conservados foi utilizado Batch-Web CDD-Search (NCBI). Para análises filogenéticas, as sequências foram alinhadas e refinadas, Mr. Bayes e IQTree foram utilizados para construção das árvores. Foram identificadas três sequências da família Argonauta, e duasda subfamília Piwi. Todas as sequências de Argonauta e Piwi revelaram a presença dos dominios proteicos característicos da família, nenhum splicing alternativo foi encontrado. No contexto filogenético, as sequências de Argonauta de S. leucops formaram um clado distintivo junto a representantes de planárias de vida livre, moluscos, trematódeos e cestodas, enquanto sequências de Piwi se agruparam de forma robusta com organismo que compartilham Piwi1. Não foi encontrada diferença na expressão dos genes argonauta e piwi em animais com I e II zooides em Stenostemum.

The genus Stenostomum is composed of free-living microturbularians belonging to the Caten- ulida class, which is the most basal group of Platyhelminthes. They are cosmopolitan, distrib- uted globally. Most species reproduce asexually by paratomy through the formation of zooids, new worms grow from the posterior end of the anima and can form chains of individuals. These animals can be identified as potential model organisms due to their easy maintenance in the laboratory, mainly because they have asexual reproduction and great regenerative capacity. Mi- croRNAs are small non coding RNAs that have important functions in gene regulation and can be divided into two groups depending on the protein they interact with: i) Argonautes that si- lence target genes at transcriptional and post transcriptional levels; ii) Piwi family proteins that protect the genome from the mutational activity of transposable elements in the germline in animals. MicroRNAs can influence the regeneration process in planarians in different ways. In this way, a detailed analysis of the genomic composition, in S. leucops, of the genes from the Argonaute and Piwi families, can contribute to the understanding of the role of miRNAs in the state of cellular totipotency of Platyhelminthes and whether this characteristic was already pre- sent in the most basal group. For the study, Argonaute and Piwi protein sequences were ob- tained from other organisms from the Platyhelminthes group and external groups, for compar- ison with those from Stenostomum leucops, these were obtained through literature and online databases (WormBase Parasite, NCBI and FlyBase). Our group, the genome using long-reads (Nanopore) and short-reads(Ilumina), sequenced the genomes and transcripts of S.leucops. The transcriptome for one and two zooids (Iontorrent S5). Augustus software was used to predict genes, with training of the respective protein sequences for subsequent location in the S.leucops genome. The sequences found were also annotated manually using the Ugene software and functionally with eggNOG mapper. To identify conserved domains, Batch-Web CDD-Search (NCBI) was used. For phylogenetic analyses, the sequences were aligned and refined, Mr. Bayes and IQTree were used to build the trees. Three sequences from the Argonaute family were identified, and two from the Piwi subfamily. All Argonaute and Piwi sequences revealed the presence of the protein domains characteristic of the family, no alternative splicing was found. In the phylogenetic context, Argonaute sequences from Stenostemum leucops formed a distinctive clade alongside representatives of free living planarians, molluscs, trematodes and cestodes, while Piwi sequences grouped robustly with organisms that share Piwi1. No differ- ence was found in the expression of the argonaut and piwi genes in animals with I and II zooids in Stenostemum.