Aplicação de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier para diagnóstico da paracoccidioidomicose

Abstract

Introdução: a paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose granulomatosa crônica endêmica da América Latina, com maior ocorrência no Brasil. A PCM é causada pelos fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides, cujo habitat mais provável é o solo, onde eles se encontram na forma de micélio. A doença é adquirida pela inalação de propágulos fúngicos e, nos pulmões, ocorre a transformação na forma de levedura. A partir dos pulmões, qualquer órgão ou sistema pode ser afetado, pois a PCM é uma doença polimórfica. O “padrão ouro” para diagnóstico é a visualização do fungo em amostras clínicas. A sorologia também é frequentemente utilizada, como ferramenta diagnóstica auxiliar e para classificar a severidade da doença, monitorar a efetividade do tratamento e indicar a cura do paciente. Entretanto, os métodos diagnósticos usuais apresentam limitações. Objetivo: Desenvolver novos métodos diagnósticos para a PCM baseados em espectroscopia FTIR e análises quimiométricas. Métodos: Foram analisadas 224 amostras de soro do repositório da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP). Destas, 132 amostras eram de pacientes com PCM, diagnosticados a partir da visualização do fungo em amostras clínicas, além da realização de imunodifusão dupla em gel de ágar (IDD) com titulação de anticorpos. As outras 92 amostras constituíram o grupo controle: 50 amostras de indivíduos saudáveis e 42 amostras de pacientes com outras micoses sistêmicas (24 de aspergilose, 10 de criptococose e 8 de histoplasmose). As amostras foram analisadas no espectrômetro Spectrum 400 FTIR/FTNIR (Perkin-Elmer, Inc., Waltham, USA) acoplado a um acessório de reflectância total atenuada (ATR). Uma alíquota de 1 μL de cada amostra foi depositada no cristal do equipamento, e a leitura foi realizada na forma líquida e na forma desidratada (secagem por 1 minuto em ar corrente a 60-65 °C). Os espectros foram adquiridos em triplicata na faixa de 4000 a 650 cm-1. As análises quimiométricas foram realizadas nos softwares Pirouette 4.5 (Infometrix, Bothell, USA) e The Unscrambler® X 10.4 (Camo Analytics, Bedford, USA). Os espectros foram pré-tratados e dois algoritmos diferentes foram propostos para diagnóstico da PCM: análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e análise discriminante linear (LDA). Também foi desenvolvido um modelo com a regressão por mínimos quadrados parciais (PLS) para realizar a predição dos títulos de anticorpos das amostras de soro dos pacientes com PCM. Para todas as modelagens, o conjunto de amostras foi dividido em conjunto de calibração e conjunto de validação externa. Resultados: ambas as modelagens propostas para o diagnóstico da PCM (PLS-DA e LDA) obtiveram 100% de sensibilidade, especificidade e acurácia no conjunto de validação externa. A modelagem PLS para predição dos títulos de anticorpos apresentou erro mínimo, com erro quadrático médio da previsão (RMSEP) igual a 0,0093 e coeficiente de determinação maior que 0,9999 no conjunto de validação externa. Conclusão: nesta pesquisa, foram propostas duas aplicações da espectroscopia FTIR (diagnóstico e predição de títulos de anticorpos) que se mostraram promissoras para melhorar o manejo clínico de pacientes com PCM.

Background: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a chronic granulomatous mycosis endemic to Latin America, with greater occurrence in Brazil. PCM is caused by thermodimorphic fungi of the genus Paracoccidioides, whose most likely habitat is soil, where they are found in the form of mycelium. The disease is acquired by inhalation of fungal propagules and, in the lungs, transformation occurs into the yeast form. Starting from the lungs, any organ or system can be affected, as PCM is a polymorphic disease. The “gold standard” for diagnosis is the visualization of the fungus in clinical samples. Serology is also frequently used as an auxiliary diagnostic tool and to classify the severity of the disease, monitor the effectiveness of treatment and indicate the patient's cure. However, the usual diagnostic methods have limitations. Objective: Develop new diagnostic methods for PCM based on FTIR spectroscopy and chemometric analyses. Methods: A total of 224 serum samples from the Botucatu Faculty of Medicine (UNESP) repository were analyzed. Of these, 132 samples were from patients with PCM, diagnosed through visualization of the fungus in clinical samples, in addition to performing double immunodiffusion in agar gel (IDD) with antibody titration. The other 92 samples constituted the control group: 50 samples from healthy individuals and 42 samples from patients with other systemic mycoses (24 from aspergillosis, 10 from cryptococcosis and 8 from histoplasmosis). Samples were analyzed on the Spectrum 400 FTIR/FTNIR spectrometer (Perkin-Elmer, Inc., Waltham, USA) coupled to an attenuated total reflectance (ATR) accessory. An aliquot of 1 μL of each sample was deposited on the equipment's crystal, and the reading was carried out in liquid form and in dehydrated form (drying for 1 minute in air current at 60-65 °C). Spectra were acquired in triplicate in the range from 4000 to 650 cm-1. Chemometric analyzes were performed using Pirouette 4.5 (Infometrix, Bothell, USA) and The Unscrambler® X 10.4 (Camo Analytics, Bedford, USA) software. The spectra were pre-treated and two different algorithms were proposed for PCM diagnosis: partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) and linear discriminant analysis (LDA). A partial least squares (PLS) regression model was also developed to predict antibody titers in serum samples from patients with PCM. For all modeling, the sample set was divided into a calibration set and an external validation set. Results: Both models proposed for the diagnosis of PCM (PLS-DA and LDA) achieved 100% sensitivity, specificity and accuracy in the external validation set. PLS modeling to predict antibody titers showed minimal error, with a mean squared prediction error (RMSEP) equal to 0.0093 and a coefficient of determination greater than 0.9999 in the external validation set. Conclusion: In this research, two applications of FTIR spectroscopy (diagnosis and prediction of antibody titers) were proposed and showed promise for improving the clinical management of patients with PCM.