Papel neuroprotetor do lactato em condições hipóxico-isquêmicas

Abstract

A encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) neonatal é uma das principais causas de mortalidade em recém-nascidos, cuja única terapia clínica preconizada é a hipotermia terapêutica, a qual apresenta limitações. O lactato tem recebido atenção por demonstrar ação neuroprotetora como substrato energético preferencial do encéfalo neonatal, além de exercer papel sinalizador via ativação do seu receptor GPR81. Recentemente, demonstramos que o lactato melhora os desfechos comportamentais e morfológicos em ratos neonatos submetidos à hipóxia-isquemia (HI). Entretanto os mecanismos de ação neuroprotetora do lactato seguem pouco conhecidos. Essa Tese buscou responder se as ações do lactato após a HI neonatal melhoram desfechos histológicos e comportamentais na vida adulta; e se o lactato teria uma ação dual, atuando como substrato metabólico e como sinalizador anti-inflamatório via GPR81. Inicialmente, para o capítulo I, foi realizada uma revisão da literatura sobre o papel do lactato em condições hipóxico-isquêmicas em recém-nascidos. Referente aos estudos in vitro (capítulo II), linhagens de microglia (BV-2) ou neurônios (SH-SY5Y) foram submetidas à privação de glicose e oxigênio (OGD) por 6h na presença de lactato ou do agonista do receptor GPR81. Na sequência, foram expostas a um período de reoxigenação por 24h – sem tratamento com lactato ou agonista do GPR81. Abordando os estudos in vivo (capítulo III), ratos Wistar machos e fêmeas com 7 dias de vida (P7) foram submetidos à oclusão permanente da artéria carótida comum direita (isquemia) combinada com a exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de oxigênio) por 60 minutos (hipóxia). Os animais foram divididos em 4 grupos experimentais: grupo HI (animais submetidos ao procedimento de HI neonatal); grupo HI+LAC (animais submetidos ao procedimento de HI neonatal e que receberam injeções de lactato após a HI); grupo SHAM (animais submetidos a uma cirurgia fictícia e mantidos em normoxia); grupo SHAM+LAC (animais submetidos a uma cirurgia fictícia, mantidos em normoxia e que receberam injeções de lactato). O lactato foi administrado 30 min e 2h após a hipóxia no grupo HI+LAC e nos mesmos momentos no grupo SHAM+LAC. Os grupos HI e SHAM receberam apenas a injeção de veículo (PBS). Os animais foram submetidos aos testes comportamentais de geotaxia negativa e reflexo de endireitamento (P8); teste do cilindro (P24); escore neurológico (P25), campo aberto e reconhecimento de objetos (P54-59) e acompanhados até a idade adulta (P60) para avaliação de parâmetros morfológicos (pela coloração histológica com violeta de cresil) e moleculares (RT-qPCR). Inicialmente, a revisão abriu possibilidades para uma avaliação metabólica e sinalizadora do lactato em condições hipóxico-isquêmicas, conforme relatadas. Nossos achados in vitro demonstraram que o lactato impediu a morte celular causada pela OGD em microglia e neurônios, enquanto a ativação do receptor evitou a morte celular secundária associada ao período de reoxigenação. Em animais submetidos à HI, a administração de lactato reduziu o volume de lesão encefálica e levou a melhoras nas respostas na geotaxia negativa, teste do cilindro, escore neurológico e reconhecimento de objetos, tanto em machos quanto em fêmeas. Nossos dados sugerem que o lactato é um substrato metabólico prontamente utilizado por células neurais, além de exercer um efeito de sinalização, o qual está associado a uma neuroproteção observada tardiamente. Ainda, parece que o lactato exerce um efeito neuroprotetor de longo prazo, reduzindo a lesão encefálica na idade adulta, o que pode ter sido importante para a melhora dos desfechos comportamentais observada nos períodos neonatal, juvenil e adulto. Estudos adicionais são necessários para permitir a compreensão dos mecanismos de ação do lactato e sua utilização no tratamento de recém-nascidos que passaram por eventos hipóxico-isquêmicos encefálicos.

Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is one of the main causes of mortality in newborns, to which the only recommended clinical therapy is therapeutic hypothermia, which has limitations. Lactate has received attention for demonstrating neuroprotective action as a preferential energy substrate of the neonatal brain, in addition to playing a signaling role via activation of its receptor GPR81. Recently, we demonstrated that lactate improves behavioral and morphological outcomes in neonatal rats subjected to hypoxia-ischemia (HI). However, the mechanisms of lactate's neuroprotective action remain poorly understood. This thesis sought to answer whether the actions of lactate after neonatal HI improve histological and behavioral outcomes in adult life; and whether lactate would have a dual role, acting as a metabolic substrate and as an anti-inflammatory signal via GPR81. Initially, a literature review (chapter I) was carried out on the role of lactate in HI conditions in newborns. Regarding the in vitro (chapter II) studies, cell lines of microglia (BV-2) or neurons (SH-SY5Y) were subjected to glucose and oxygen deprivation (OGD) for 6 hours in the presence of lactate or the GPR81 receptor agonist. They were then exposed to a period of reoxygenation for 24 hours – without lactate treatment or GPR81 agonist. Addressing the in vivo (chapter III) studies, 7-day-old male and female Wistar rats (P7) were subjected to permanent occlusion of the common right carotid artery (ischemia) combined with exposure to a hypoxic atmosphere (8% oxygen) for 60 minutes (hypoxia). The animals were divided into 4 experimental groups: HI group (animals submitted to the neonatal HI procedure); HI+LAC group (animals that underwent the neonatal HI procedure and received lactate injections after HI); SHAM group (animals that underwent sham surgery and were maintained in normoxia); SHAM+LAC group (animals that underwent sham surgery, were maintained in normoxia and received lactate injections). Lactate was administered 30 min and 2 h after hypoxia in the HI+LAC group and at the same timepoints in the SHAM+LAC group. The HI and SHAM groups received only the vehicle injection (PBS). Animals were subjected to negative geotaxis and righting reflex (P8) behavioral tests; cylinder test (P24); neurological score (P25), open field and object recognition (P54-59) and followed until adulthood (P60) to evaluate morphological (by histological staining with cresyl violet) and molecular (RT-qPCR) parameters. The literature review opened possibilities for a metabolic and signaling functions of lactate in hypoxic-ischemic conditions, as reported. Lactate prevented cell death caused by OGD in microglia and neurons, while receptor activation prevented secondary cell death associated with the reoxygenation period. In animals subjected to HI, lactate administration reduced the volume of brain injury and led to improvements of behavioral responses in negative geotaxis, cylinder test, neurological score and object recognition, both in males and females. Our data suggest that lactate is a metabolic substrate readily used by neural cells, in addition to exerting a signaling effect, which is associated with a late neuroprotection. Furthermore, it appears that lactate exerts a long-term neuroprotective effect, reducing brain injury in adulthood, which may have been important for the improvement of behavioral outcomes observed in the neonatal, juvenile and adult periods. Additional studies are necessary to understand the mechanisms of action of lactate and allow its clinical use in the treatment of newborns who have undergone brain hypoxic-ischemic events.