Controle de qualidade de doses inseminantes suínas : aspectos quantitativos e qualitativos

Abstract

Apesar dos atuais e expressivos esforços empregados pelas centrais de inseminação artificial para garantir a qualidade das doses inseminantes suínas, ainda existem lacunas a serem preenchidas bem como oportunidades a serem exploradas no que diz respeito ao processo de controle de qualidade. Desta forma, foram conduzidos cinco experimentos para melhor compreender a influência de fatores quanti e qualitativos sobre a qualidade espermática e, também, para otimizar o processo de avaliação da qualidade das doses inseminantes suínas. O primeiro estudo avaliou o efeito de doses de sêmen suíno com diferentes concentrações espermáticas em 50 mL de Androstar Plus® (APlus; 20, 30, 60 e 100 × 106 células/mL) sobre a qualidade espermática e observou-se aumento da motilidade total (MT) à medida que a concentração espermática aumentou de 20 para 30 × 106 células/mL. Porém, a MT diminuiu conforme a concentração de células aumentou para 60 e 100 × 106/mL (P quadrático < 0,01). Além disso, os valores limite para atingir pelo menos 70% de MT às 120 h de armazenamento foram 4 e 59 × 106 células/mL, enquanto o valor que não afetou mais a MT foi de 50 × 106 células/mL (72% de MT). O segundo estudo comparou doses com baixa concentração espermática (16,7 × 106 células/mL em 90 mL) e doses mais concentradas (33,3 × 106 células/mL em 45 mL) produzidas com BTS ou APlus. Os dados demonstraram que, após 300 min de incubação a 38°C (teste de termorresistência; TTR), as doses de baixa concentração perderam 2 a 3 vezes menos pontos percentuais (pp) de MT em relação às doses com 33,3 × 106 células/mL (P < 0,01) independentemente do tipo de diluente. No terceiro estudo, foi verificada a influência de diferentes proporções de espermatozoides mortos (25%, 50% e 75%) na qualidade de doses de sêmen suíno ao longo do TRT (30 e 300 min). No início do teste, os tratamentos apresentaram medianas para MT de 77,6%, 50,2% e 25,6%, respectivamente. As doses com 25%, 50% ou 75% de células mortas perderam uma proporção semelhante de MT ao longo do TTR: 25% = -11,9%, 50% = -16,0% e 75% = -17,5% (P = 0,31). Além disso, a variação relativa dos parâmetros analisados por citometria de fluxo (CF) sugeriu que a presença das células mortas não alterou substancialmente a estrutura espermática ao longo do TTR. O quarto estudo comparou diversos protocolos de CF (BEADS: SYBR+PI+beads; SYBR, SYBR+PI, SYTO-24, TRITON: Triton+PI e GATING) com métodos convencionais para mensurar a concentração espermática de doses de sêmen suíno (NEUB: Câmara de Neubauer; CASA: Sistema computadorizado; NC: NucleoCounter). Todos os protocolos de CF apresentaram maior coeficiente de variação entre as duplicatas (CV) em comparação com NEUB (4,9%) ou CASA (3,6%), enquanto os métodos NEUB e CASA apresentaram o menor CV (4,9 e 3,6%, respectivamente). Baixos coeficientes de concordância de correlação (CCC) foram observados entre os protocolos de CF e os métodos convencionais, bem como entre os próprios protocolos de CF (BEADS vs. SYTO-24 = 0,10). Por fim, o último estudo desenvolveu um painel de CF com cinco fluorocromos para analisar simultaneamente atividade mitocondrial (A), grau de desorganização lipídica da membrana plasmática (B), integridade da membrana plasmática (C) e status acrossomal (D) em doses de sêmen suíno, adicionando-se um marcador de DNA (E). Fortes correlações e valores moderados e substanciais de CCC entre os ensaios individuais para cada fluorocromo e o ensaio multicolor foram encontrados para todos os parâmetros (0,99/0,99; 0,96/0,96; 0,93/0,92; 0,98/0,98 e 0,99/0,99 para A, B, C, D e E; P < 0,01, respectivamente), e a diferença média entre as abordagens não ultrapassou 0,84.

Despite the current and significative efforts applied by artificial insemination centers to guarantee boar semen does quality, there are still gaps to be filled and opportunities to be explored regarding the quality control process. Therefore, five experiments were performed to understand better the influence of some quantitative and qualitative factors on sperm quality and optimize the evaluation of boar semen doses quality. The first study evaluated the effect of boar semen doses with different sperm concentrations, in 50 mL of Androstar Plus® (APlus; 20, 30, 60 e 100 × 106 células/mL) on sperm quality, and it was observed an increase in total motility (TM) as the sperm concentration increased from 20 to 30 × 106 cells/mL. However, it decreased as the sperm concentration increased to 60 and 100 × 106 cells/mL (P quadratic < 0.01). Limit values to reach at least 70% TM at 120 h of storage were defined as 4 and 59 × 106 cells/mL, and the value which no longer affected the TM was 50 × 106 cells/mL (72% TM). The second investigation further assessed the sperm concentration effect on boar sperm quality, but focusing on the sperm resilience and the extender type. Low-concentrated doses (16.7 × 106 cells/mL in 90 mL) and higher concentrated doses (33.3 × 106 cells/mL in 45 mL) produced with BTS or APlus were compared. After 300 min of incubation at 38°C (thermo-resistance test; TRT), the low-concentrated doses lost 2 to 3-fold less pp of TM than the doses with 33.3 × 106 cells/mL (P < 0.01), regardless of the extender type. In the third study, the influence of different proportions of dead spermatozoa (25%, 50% and 75%) on the quality boar semen doses over a TRT was verified (30 and 300 min). Doses with 25%, 50% or 75% of dead cells lost similar proportion of TM over the TRT: 25% = -11.9%, 50% = -16.0% and 75% = -17.5% (P = 0.31). Regarding the flow cytometry parameters (FC), the relative variation suggested that dead sperm did not substantially change sperm structure over the TRT. The fourth study compared different FC protocols (BEADS: SYBR+PI+beads; SYBR, SYBR+PI, SYTO-24, TRITON: Triton+PI, and GATING) to conventional methods to measure sperm concentration of boar semen doses (NEUB: Neubauer chamber; CASA: Computer Assisted Semen Analysis; NC:NucleoCounter). All the FC protocols had higher coefficient of variation between replicates (CV) compared to NEUB (4.9%) or CASA (3.6%), while the NEUB and CASA methods showed the lowest CV (4.9 and 3.6%, respectively). The comparison BEADS vs. NC presented the highest correlation coefficient (0.83), and the methods NEUB vs. SYTO-24 showed the lowest coefficient (0.54; P < 0.01). Poor coefficients of correlation concordance (CCC) were observed between the FC protocols and the conventional methods, as well as between the FC protocols (BEADS vs. SYTO-24 = 0.10). Finally, the last study developed a 5-color FC panel to concurrently analyze mitochondrial activity (A), degree of lipid disorder of plasma membrane (B), integrity of plasma membrane (C), acrosomal status (D) in boar semen doses, while adding a DNA-marker (E). Strong correlations as well as moderate and substantial CCC values were found between the single staining assays and the 5-color staining assay regarding all parameters (0.99/0.99; 0.96/0.96; 0.93/0.92; 0.98/0.98, and 0.99/0.99) for A, B, C, D, and E; P < 0.01, respectively), and the mean difference between the methods did not overtake 0.84.