Detecção da atividade da purino nucleosídeo fosforilase (EC 2.4.2.1) em líquido cérebro espinhal de rato e determinação de estrutura tridimensional e parâmetros cinéticos da enzima humana recombinante com 7-metil-6-tio-guanosina

Abstract

A enzima purino nucleosídeo fosforilase catalisa a clivagem reversível da ligação N-ribosídica de nucleosídeos purínicos, gerando ribose 1-fosfato e a base púrica correspondente. Esta é uma etapa importante na via de salvamento de purinas, controlando o fluxo de compostos a ser excretados, na forma de ácido úrico, e revertendo-o para a formação de nucleotídeos, de acordo com a necessidade celular. Essa atividade enzimática é ubíqua, entretanto apresenta importância fundamental em linfócitos-T, visto que a ausência dessa enzima em humanos, característica de uma desordem genética, acarreta morte a tais células, embora todos os outros tipos celulares permaneçam normais. Esse fato suscitou um grande interesse nessa enzima, pois drogas que a inibam poderiam ser empregadas como imunossupressores, visando à intervenção clínica em casos de doenças auto-imunes, leucemias e linfomas de células-T e rejeição de órgãos transplantados. Com o intuito de desenvolver inibidores da enzima, seu mecanismo catalítico tem sido amplamente estudado. Recentemente, foi demonstrado que nucleosídeos purínicos são capazes de proteger células cerebrais expostas a danos quimicamente induzidos, indicando que a purino nucleosídeo fosforilase possa exercer também algum papel nesse processo. Com o objetivo de adquirir maior conhecimento a respeito da interação da enzima humana com seus ligantes, estudos cinéticos e estruturais da mesma foram realizados, utilizando 7-metil-6-tio-guanosina, um nucleosídeo sintético, como substrato, possibilitando a interpretação dos parâmetros cinéticos em nível atômico. Numa abordagem para investigar o possível papel da purino nucleosídeo fosforilase na proteção de células nervosas, a atividade dessa enzima foi medida em líquido cérebro espinhal de rato, demonstrando, pela primeira vez, sua presença em meio extracelular, seguido de uma caracterização cinética aparente da enzima, utilizando o substrato supracitado. Os resultados com a enzima humana podem auxiliar no desenvolvimento de novas drogas contra desordens do sistema imunológico, enquanto o trabalho com líquido cérebro espinhal de rato é um passo inicial almejando a elucidação da função da via de catabolismo de purinas em células cerebrais.

The enzyme purine nucleoside phosphorylase catalyzes the reversible cleavage of N-ribosidic bonds of purine nucleosides, generating ribose 1-phosphate and the corresponding purine base. That is an important step of purine salvage pathway, controlling the flow of compounds to be excreted, in uric acid form, and reverting it to the nucleotide formation, according to the cellular demand. This enzymatic activity is ubiquitous, nevertheless it is vital in T lymphocytes, since the lack of that enzyme in humans, due to a genetic disorder, leads to impairment of such cells, though keeping normal other tissues. This fact has attracted a large interest in purine nucleoside phosphorylase, since drugs capable of inhibiting this enzyme might be employed as immune-modulators, aiming at developing clinical procedures in cases of autoimmune diseases, leukemia and lymphomas, and organ transplantation rejection. With the intent of developing purine nucleoside phosphorylase inhibitors, its catalytic mechanism has been widely studied. Recently, purine nucleotides were demonstrated to protect brain cells exposed to chemically-induced injuries, and a role for purine nucleoside phosphorylase in this process was suggested. With the goal of acquiring a better knowledge about the interaction between the human enzyme and its ligand molecules, kinetic and structural studies were performed, utilizing 7-methyl-6-thio-guanosine, a synthetic nucleoside, as substrate, allowing the interpretation of kinetic parameters at atomic level. As an approach to investigate the role of this enzyme in neuron protection, its activity was measured in rat cerebrospinal fluid, which showed, for the first time, its presence in extra-cellular medium, followed by an apparent kinetic characterization of the enzyme with the substrate cited above. Results with the human enzyme can aid the development of new drugs against immunological disorders, whereas those concerning rat cerebrospinal fluid are and initial step towards elucidating the function of purine catabolism pathway in brain cells.