Investigação da atuação de mecanismos genéticos, epigenéticos e ambientais no desenvolvimento da obesidade

Abstract

A obesidade é uma doença crônica caraterizada pelo acúmulo de gordura no tecido adiposo, sendo decorrente do desequilíbrio entre a ingesta e o gasto calórico. Devido ao aumento exponencial da prevalência da obesidade no mundo, esta doença tem sido considerada como a epidemia do século 21. Além de ser frequente em indivíduos adultos, a frequência em crianças também tem crescido mundialmente e estudos mostram que a doença tende a permanecer na vida adulta. A obesidade é uma doença complexa e multifatorial visto que sua fisiopatologia envolve a interação entre fatores genéticos, epigenéticos e ambientais. Diversos fatores genéticos influenciam a suscetibilidade à obesidade, explicando cerca de 65% da variabilidade da doença. A análise integrativa de dados genéticos de diferentes populações, através de biologia de sistemas, pode contribuir para um melhor entendimento da fisiopatologia da obesidade infantil. Dessa forma, no primeiro artigo, realizamos uma busca sistemática de genes candidatos relacionados à obesidade infantil utilizando o banco de dados público DisGeNET. Foram identificados 191 genes associados com a doença, sendo que 12 destes genes foram considerados como hubbottleneck (INS, LEP, STAT3, POMC, ALB, TNF, BDNF, CAT, GCG, PPARG, VEGFA e ADIPOQ) após análises de rede de interação proteína-proteína. As análises de enriquecimento funcional indicam que estes genes estão envolvidos em vias relacionadas à inflamação, termogênese, metabolismo de glicose e lipídeos e sinalização de citocinas. Além disso, foram identificados 4 módulos funcionais para este grupo de 191 genes. De um modo geral, este estudo foi capaz de identificar um grupo de genes altamente interconectados associado com a obesidade infantil. Os fatores genéticos não conseguem explicar isoladamente a variabilidade e o aumento da prevalência de obesidade. Neste contexto, mudanças em mecanismos epigenéticos foram observadas em adultos e crianças com obesidade. A metilação, um dos principais mecanismos epigenéticos, regula negativamente a expressão gênica em resposta a fatores ambientais. Apesar de alguns estudos sugerirem que genes diferencialmente metilados (DMGs) estão associados com a obesidade infantil, os resultados ainda são inconclusivos. Além disso, padrões de metilação tendem a ser persistentes ao longo da vida. Dessa forma, a identificação de genes diferencialmente expressos (DEGs) regulados por metilação (MeDEGs) pode contribuir para o entendimento dos eventos moleculares complexos envolvidos na obesidade infantil. Neste contexto, no segundo artigo da tese, investigamos MeDEGs associados com a obesidade infantil através de uma análise integrativa in silico. Para isto, 4 datasets contendo dados globais de expressão (um de expressão gênica e 3 de metilação) foram obtidos no banco de dados público Gene Expression Omnibus. Após a sobreposição das listas dos 859 DEGs e 3,455 DMGs, foram identificados 70 MeDEGs. Entre eles, 25 genes apresentaram padrão hipermetilado-expressão reduzida e 45 apresentaram padrão hipometilado-expressão aumentada no tecido adiposo visceral (TAV) de crianças com obesidade comparado a crianças sem obesidade. A rede de interação proteína-proteína desses MeDEGs apresentou 3 genes hub-bottleneck (CCL5, STAT1 e GATA3) e dois módulos funcionais. Análises de enriquecimento funcional demonstram que estes MeDEGs estão envolvidos em processos de diferenciação celular, inflamação, sinalização de citocinas, metabolismo de glicose e lipídeos, resistência à insulina (RI) e apoptose. Os resultados deste estudo indicam uma lista de MeDEGs envolvidos na obesidade infantil, bem como identifica vias metabólicas em que eles atuam, fornecendo uma compreensão mais profunda dos mecanismos reguladores da obesidade infantil mediados por metilação de DNA. Embora a suscetibilidade genética e os mecanismos epigenéticos apresentem papel importante no desenvolvimento da obesidade, fatores ambientais, como sedentarismo e padrões de dieta, são considerados fatores-chave por trás do aumento exponencial de doenças metabólicas relacionadas à obesidade. A dieta de cafeteria (DCAF) ou dieta ocidental é hipercalórica e rica em alimentos ultraprocessados e de baixa densidade nutricional, possuindo potencial inflamatório e oxidativo. A exposição de camundongos à DCAF mimetiza os padrões de consumo alimentar humano e serve como modelo de estudo da obesidade; entretanto, as alterações metabólicas e nutrigenômicas nesse modelo são pouco conhecidas. Sendo assim, no 3° artigo da tese, implementamos um modelo de obesidade induzida por DCAF em camundongos para investigar as alterações metabólicas associadas, bem como a expressão de diversos genes relacionados a rotas das adipocitocinas, inflamação, apoptose e metabolismo da glicose no TAV, tecido adiposo subcutâneo (TAS), fígado e músculo. Para isto, foram incluídos 40 camundongos C57BL/6 machos, sendo 20 que receberam dieta padrão (DP) e 20, DCAF (CAF). Após 16 semanas de seguimento, o grupo CAF ganhou mais peso e apresentou uma glicemia média maior comparado aos controles. Ainda, o escore de esteatose hepática, índice de RI e níveis de adiponectina e leptina foram maiores no grupo CAF. Com relação às análises de expressão gênica, observou-se 19 genes desregulados no TAV, 6 genes no TAS, 11 genes no fígado e 4 genes no músculo esquelético destes animais comparados ao grupo DP. Além disso, a relação Itgax/Llgl1 foi aumentada no TAV dos camundongos expostos à DCAF, indicando uma mudança no fenótipo dos macrófagos de M2 para M1, que é o inflamatório. Com isso, foi possível padronizar um modelo de DCAF em camundongos C57BL/6 e descrever as alterações metabólicas e moleculares associadas a este modelo. Alguns estudos têm demonstrado que o mirtilo apresenta ação benéfica na obesidade, reduzindo a inflamação e o estresse oxidativo, bem como atenuando o ganho de peso em humanos e em modelos animais. Entretanto, nenhum estudo testou a eficácia da adição do mirtilo a uma dieta como a DCAF. Dessa forma, no nosso 4° artigo, avaliamos o efeito do consumo de mirtilo sobre parâmetros biométricos, metabólicos e nutrigenômicos em camundongos expostos à DCAF. Foram incluídos 32 camundongos C57BL/6 machos distribuídos em 3 grupos experimentais: controle (n= 10; DP), DCAF (n= 12, CAF) e mirtilo + DCAF (n= 10, BB). O consumo de mirtilo preveniu o ganho de peso induzido pela DCAF visto que após 16 semanas de seguimento, os animais apresentaram peso similar aos animais do grupo DP. O índice de Lee (equivalente ao índice de massa corporal) e o delta-peso (peso final - peso inicial) também foram maiores no grupo CAF comparado aos grupos DP e BB. Além disso, o mirtilo foi capaz de prevenir parcialmente o aumento da glicemia de jejum, RI e protegeu contra a esteatose hepática e estresse oxidativo no fígado e hipotálamo. As análises de expressão gênica demonstraram que o mirtilo foi capaz de modular 16 genes no TAV, 10 genes no TAS, 4 no tecido adiposo marrom, 12 genes no fígado, 5 no músculo esquelético e 4 no hipotálamo dos animais do grupo BB. Ainda, a relação Itgax/Llgl1 também foi aumentada no TAV dos camundongos DCAF comparado aos grupos BB e DP. Em conclusão, os estudos incluídos nesta tese evidenciaram o papel de fatores genéticos, epigenéticos e ambientais no desenvolvimento da obesidade. Em especial, foram identificados genes candidatos e MeDEGs envolvidos na patogênese da obesidade infantil, bem como as vias e processos biológicos nas quais estes genes estão envolvidos. Ainda, foi possível implementar um modelo de DCAF para a indução de obesidade em camundongos C57BL/6, bem como avaliar as alterações biométricas, metabólicas e nutrigenômicas envolvidas neste modelo. Por fim, foi possível investigar o importante efeito do consumo de mirtilos para tratamento da obesidade, o qual melhorou desfechos biométricos, glicêmicos, metabólicos, de estresse oxidativo e nutrigenômicos. Assim, podemos considerar o consumo de mirtilo como uma estratégia dietética promissora para prevenir disfunções metabólicas associadas à obesidade.

Obesity is a chronic disease characterized by the accumulation of fat in adipose tissue, resulting from an imbalance between calorie intake and expenditure. Due to the exponential increase in the prevalence of obesity worldwide, this disease has been considered the epidemic of the 21st century. In addition to being prevalent in adults, its prevalence in children has also grown worldwide, and studies have shown that the disease tends to persist into adulthood. Obesity is a complex and multifactorial disease as its pathophysiology involves the interaction between genetic, epigenetic, and environmental factors. Several genetic factors influence the susceptibility to obesity, explaining approximately 65% of the disease variability. The integrative analysis of genetic data from different populations through systems biology approach can contribute to a better understanding of the pathophysiology of childhood obesity. Thus, in the first article, we conducted a systematic search for candidate genes related to childhood obesity using the public database DisGeNET. We identified 191 genes associated with the disease, of which 12 were considered hub-bottleneck genes (INS, LEP, STAT3, POMC, ALB, TNF, BDNF, CAT, GCG, PPARG, VEGFA, and ADIPOQ) after protein-protein interaction network analyses. Functional enrichment analyses indicate that these genes are involved in pathways related to inflammation, thermogenesis, glucose and lipid metabolism, and cytokine signaling. Additionally, four functional modules were identified for this group of 191 genes. Overall, this study was able to identify a group of highly interconnected genes associated with childhood obesity. Genetic factors alone cannot fully explain the variability and increasing prevalence of obesity. In this context, changes in epigenetic mechanisms have been observed in both adults and children with obesity. Methylation, one of the main epigenetic mechanisms, negatively regulates gene expression in response to environmental factors. Although some studies have suggested that differentially methylated genes (DMGs) are associated with childhood obesity, the results remain inconclusive. Additionally, methylation patterns tend to persist throughout life. Therefore, the identification of differentially expressed genes (DEGs) regulated by methylation (MeDEGs) can contribute to the understanding of the complex molecular events involved in childhood obesity. In this context, in the second article of this thesis, we investigated MeDEGs associated with childhood obesity through an integrative in silico analysis. For this, four datasets containing global expression data (one for gene expression and three for methylation) were obtained from the public database Gene Expression Omnibus. After overlapping the lists of 859 DEGs and 3,455 DMGs, 70 MeDEGs were identified. Among them, 25 genes showed a hypermethylated-low expression pattern, and 45 showed a hypomethylated-high expression pattern in visceral adipose tissue (VAT) of children with obesity compared to children without obesity. The protein-protein interaction network of these MeDEGs presented 3 hub-bottleneck genes (CCL5, STAT1, and GATA3) and two functional modules. Functional enrichment analyses demonstrate that these MeDEGs are involved in processes of cell differentiation, inflammation, cytokine signaling, glucose and lipid metabolism, insulin resistance (IR), and apoptosis. The results of this study indicate a list of MeDEGs involved in childhood obesity, and identifies metabolic pathways in which they act, providing a deeper understanding of the regulatory mechanisms of childhood obesity mediated by DNA methylation. Although genetic susceptibility and epigenetic mechanisms play an important role in the development of obesity, environmental factors, such as sedentary lifestyle and dietary patterns, are considered key factors behind the exponential increase in obesity-related metabolic diseases. The cafeteria diet (CAFD) or Western diet is hypercaloric and rich in ultra-processed foods with low nutritional density, having inflammatory and oxidative potential. Exposure of mice to CAFD mimics human dietary consumption patterns and serves as a model for studying obesity; however, the metabolic and nutrigenomic alterations in this model are poorly understood. Thus, in the third article of the thesis, we implemented a model of obesity induced by CAFD in mice to investigate the associated metabolic changes, as well as the expression of various genes related to adipocytokine, inflammation, apoptosis, and glucose metabolism pathways in VAT, subcutaneous adipose tissue (SAT), liver, and muscle. For this, 40 male C57BL/6 mice were included, with 20 receiving a standard diet (SD) and 20 receiving CAFD (CAF). After 16 weeks of follow-up, the CAF group gained more weight and had higher mean blood glucose compared to controls. Furthermore, hepatic steatosis score, IR index, and adiponectin and leptin levels were higher in the CAF group. Regarding gene expression analyses, 19 genes were dysregulated in VAT, 6 in SAT, 11 in the liver, and 4 in skeletal muscle of these animals compared to the SD group. Additionally, the Itgax/Llgl1 ratio was increased in the VAT of mice exposed to CAFD, indicating a shift in macrophage phenotype from M2 to M1, which is inflammatory. Therefore, we standardized a CAFD model in C57BL/6 mice and described the metabolic and molecular alterations associated with this model. Some studies have shown that blueberries (BB) have beneficial effects on obesity, reducing inflammation and oxidative stress, as well as attenuating weight gain in humans and animal models. However, no study has tested the effectiveness of adding BB to a diet like CAFD. Therefore, in our fourth article, we evaluated the effect of BB consumption on biometric, metabolic, and nutrigenomic parameters in mice exposed to CAFD. Thirty-two male C57BL/6 mice were included and categorized into 3 experimental groups: control (n=10; SD), CAFD (n=12, CAF), and BB + CAFD (n=10, BB). BB consumption prevented the weight gain induced by CAFD as after 16 weeks of follow-up the animals had a similar weight to those in the SD group. The Lee index (equivalent to body mass index) and delta-weight (final weight - initial weight) were also higher in the CAF group compared to the SD and BB groups. Additionally, BB partially prevented the increase in fasting blood glucose, IR, and protected against hepatic steatosis and oxidative stress in the liver and hypothalamus of the BB group. Gene expression analyses showed that BB was able to modulate 16 genes in VAT, 10 in SAT, 4 in brown adipose tissue, 12 in the liver, 5 in skeletal muscle, and 4 in the hypothalamus of these animals. Furthermore, the Itgax/Llgl1 ratio was also increased in the VAT of CAF mice compared to the BB and SD groups. In conclusion, the studies included in this thesis have highlighted the role of genetic, epigenetic, and environmental factors in the development of obesity. Specifically, candidate genes and MeDEGs involved in the pathogenesis of childhood obesity were identified, along with the biological pathways and processes in which these genes are involved. Furthermore, a CAFD model was successfully implemented for inducing obesity in C57BL/6 mice, allowing for the description of the biometric, metabolic, and nutrigenomic alterations involved in this model. Finally, the significant effect of BB consumption in the treatment of obesity was investigated, improving biometric, glycemic, metabolic, oxidative stress, and nutrigenomic outcomes. Thus, BB consumption can be considered a promising dietary strategy for preventing metabolic dysfunctions associated with obesity.