Análise da influência do microambiente tumoral ácido sobre a resposta imune no carcinoma espinocelular oral

Abstract

Uma característica marcante do microambiente dos tumores sólidos é a acidificação do pH extracelular. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do microambiente tumoral (MT) ácido sobre os mecanismos de evasão à resposta imune mediada por células T contra o carcinoma espinocelular bucal (CEC). Primeiramente foi realizado o cultivo celular das linhagens de CEC de boca (SCC25) e linfócitos T de leucemia aguda (Jurkat) de forma individual, separadas em diferentes grupos, meio neutro (pH 7.4) e ácido modificado com ácido clorídrico HCl (pH 6.8), e mantidas em estufa a 37°C e 5% de CO2, além de serem monitoradas diariamente em microscópio invertido de fase (Biostar, American Optical). Em um segundo momento foi realizado o co-cultivo dessas duas linhagens em diferentes condições experimentais e posteriormente foram avaliados desfechos em tempos experimentais distintos, como os efeitos do meio de cultura acidificado sobre os índices de morte celular de linfócitos T e das células de CEC através de ensaios de Duplicação Cumulativa da População (CPD), Imunofluorescência, Western Blot, secreção das citocinas inflamatórias interleucina-2 (IL-2) e interferon-gama (IFNγ) utilizando o kit Enzyme Linked Immunonosorbent Assay (ELISA), bem como a expressão das moléculas de reconhecimento celular PD-1 e PD-L1 por meio de citometria de fluxo, além da formação de esferas através de Cultura 3D em co-cultivo com análise morfométrica e de densidade óptica (OD). A análise estatística foi realizada através dos testes ANOVA ou ANOVA two-way, seguidos do teste de Bonferroni, post-hoc de Tukey ou teste t de Student, conforme apropriados, utilizando o programa GraphPad Prism 5.0 (La Jolla, CA). Após exposição ao meio ácido, a análise de CPD indicou diminuição da capacidade proliferativa das células T (p<0.001) e aumento nas células cancerígenas (p<0.01), além de diminuir a viabilidade das células imunes. Observou-se ainda que a acidez do MT promove alterações fenotípicas e morfológicas nas células SCC25, além de aumentar a expressão do marcador de transição epitélio-mesênquima (TEM) Vimentina. O pH ácido contribui para maior resistência das células malignas à morte induzida pelas células T (p<0.001). Não detectamos diferença na proporção de células SCC25 positivas para PD-L1 quando expostas ao meio ácido. Em contrapartida, vemos uma diminuição discreta e não significativa de PD-1 nas células T cultivadas em pH 6.8. Esferas formadas pelas células tumorais SCC25 isoladamente em seu meio ótimo para crescimento DMEM F12 demonstraram inicialmente diminuição da sua área e perímetro, além de semelhança no tamanho e agregação durante todo o período do experimento (p<0.001). Em contrapartida os esferóides mantidos em ambiente ácido apresentaram uma diminuição de área e perímetro nas primeiras 24h, seguidos por um período de estabilidade (p<0.001). Com relação a densidade óptica, as esferas nessa condição apresentaram uma OD média inicial em 12 horas significativamente mais alta (p<0.001) comparada com os grupos citados anteriormente, a qual diminuiu a partir desse período até o final do tempo experimental e que finalizou com um valor OD menor do que as esferas em pH 7.4 (p<0.001). O cocultivo de células tumorais SCC25 com células T resultou em esferas expandidas independentemente do pH, com crescimento ligeiramente maior em pH 6.8 (p<0.05). Os esferóides em meio ácido inicialmente apresentaram menor OD (p<0.001), mas essa diferença diminuiu após 72 horas. No entanto, não foi possível o processamento histológico dessas esferas devido à tendência de desagregação. No sistema de co-cultivo houve maior secreção de IFNγ em meio ácido (p>0.05). Não foi detectado IFNγ em SCC25 ou células T isoladamente em pH 7.4 ou 6.8. Os níveis de IL-2 aumentaram nas células SCC25 em pH 6.8, mas sem significância estatística; não foi detectada IL-2 nas células T em pH neutro ou ácido. Os achados deste estudo destacam a influência exercida pela acidez do MT na evasão das células cancerígenas à resposta imune e na progressão do CEC bucal, diminuindo a viabilidade e função das células T.

A striking feature of the microenvironment in solid tumors is the acidification of the extracellular pH. The aim of this study was to analyze the effects of acidic tumor microenvironment (TME) on mechanisms of evasion from T cell-mediated immune response against oral squamous cell carcinoma (OSCC). Initially, individual cell cultures of OSCC (SCC25) and acute leukemia T lymphocytes (Jurkat) were established and maintained under different experimental conditions: neutral medium (pH 7.4) and acidified medium with hydrochloric acid (HCl) (pH 6.8) at 37°C and 5% CO2. Daily monitoring was performed using a phase inverted microscope (Biostar, American Optical). Subsequently, co-culture of these two cell lines under various conditions was conducted, and outcomes were evaluated at different time points. These included the effects of acidified culture medium on cell death rates of T lymphocytes and OSCC cells using Cumulative Population Doubling (CPD) assays, Immunofluorescence, Western Blot, secretion of inflammatory cytokines interleukin-2 (IL-2) and interferon-gamma (IFNγ) assessed using Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kits, as well as the expression of cell recognition molecules PD-1 and PD-L1 by flow cytometry. Additionally, 3D sphere formation was assessed in coculture with morphometric and optical density (OD) analyses. Statistical analysis was performed using ANOVA or two-way ANOVA, followed by Bonferroni's test, Tukey's post-hoc test, or Student's t-test, as appropriate, using the GraphPad Prism 5.0 program (La Jolla, CA). After exposure to acidic medium, CPD analysis indicated decreased proliferative capacity of T cells (p<0.001) and increased proliferation in cancer cells (p<0.01), along with decreased viability of immune cells. Phenotypic and morphological changes were observed in SCC25 cells due to TME acidity, accompanied by increased expression of epithelial-mesenchymal transition (EMT) marker Vimentin. Acidic pH contributed to enhanced resistance of malignant cells to T cell-induced cell death (p<0.001). There was no significant difference detected in the proportion of PD-L1-positive SCC25 cells when exposed to acidic medium. Conversely, a slight non-significant decrease in PD-1 expression was observed in T cells cultured at pH 6.8. SCC25 tumor cell spheroids cultured alone in optimal growth medium (DMEM F12) initially showed decreased area and perimeter, with consistent size and aggregation throughout the experiment (p<0.001). In contrast, spheroids maintained in acidic environment exhibited decreased area and perimeter within the first 24 hours, followed by stability (p<0.001). Regarding optical density, spheroids in acidic conditions initially had significantly higher average OD at 12 hours (p<0.001) compared to other groups, which decreased over time and ended with a lower OD compared to pH 7.4 spheroids (p<0.001). Co-culture of SCC25 tumor cells with T cells resulted in expanded spheroids regardless of pH, with slightly greater growth at pH 6.8 (p<0.05). Initially, spheroids in acidic medium showed lower OD (p<0.001), but this difference decreased after 72 hours. However, histological processing of these spheroids was hindered by their tendency to disaggregate. In the co-culture system, there was higher secretion of IFNγ in acidic medium (p>0.05). IFNγ was not detected in SCC25 or T cells cultured alone at pH 7.4 or 6.8. IL-2 levels increased in SCC25 cells at pH 6.8, although not statistically significant; IL-2 was not detected in T cells at neutral or acidic pH. Overall, findings from this study underscore the influence of TME acidity on evasion of immune response by cancer cells and progression of oral squamous cell carcinoma, diminishing viability and function of T cells.