Avaliação funcional do transporte de glutamato Na⁺₋ dependente em cérebro de peixe-zebra adulto

Abstract

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório em cérebro de mamíferos e está envolvido em inúmeros eventos fisiológicos e patológicos. Um dos papéis mais importantes dos astrócitos é a remoção deste neurotransmissor através de transportadores específicos para glutamato (os EAATs), prevenindo a excitotoxicidade. A descoberta de novos fármacos capazes de exercer efeitos modulatórios sobre a atividade e/ou expressão dos EAATs ainda é emergente, visando condições nas quais os EAATs desempenham papel regulador chave no processo de patogênese (como déficit de atenção e hiperatividade, depressão, epilepsia, Alzheimer). Neste contexto, o peixe-zebra emergiu como um novo modelo animal para descoberta de novos fármacos, bem como modelo para doenças neurodegenerativas, complementando os estudos em roedores principalmente pela praticidade de tiragens em larga escala. Apesar dos avanços no estudo da sinalização glutamatérgica em peixe-zebra, a avaliação da funcionalidade dos transportadores ainda carece de literatura científica. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o perfil da captação de glutamato e a funcionalidade dos EAATs nas diferentes estruturas cerebrais de peixe-zebra. Foram obtidas as regiões encefálicas por dissecação (telencéfalo, teto óptico e cerebelo), que foram incubadas com substrato (0,1, 1, 10, 100 e 1000 μM), ou ouabaína 0,1 μM, ou PDC (0,01, 0,1, 1, 10, 50 e 100 μM), ou TBOA (0,01, 0,1, 1, 10 e 100 μM). O telencéfalo apresentou um valor de Vmáx de 2,324 nmol de glu/min.mg de proteína e um Km aparente de 539,7 μM. O teto óptico apresentou um valor de Vmáx de 2,210 nmol de glu/min.mg de proteína e um Km aparente de 740,5 μM, enquanto o cerebelo apresentou um valor de Vmáx de 2,241 nmol de glu/min.mg de proteína e o valor de Km aparente de 763,4 μM. A inibição da captação de glutamato na presença de 0,1 μM de ouabaína foi de 86% em telencéfalo, 89% em teto óptico e 91% em cerebelo. O inibidor PDC apresentou um IC50 de 5,287 μM para telencéfalo, 18,99 μM para teto óptico e 15,30 μM para cerebelo. Já o TBOA apresentou um IC50 de 4,53 μM para telencéfalo, 16,06 μM para teto óptico e 0,1 μM para cerebelo. Conclui-se que a captação sódio dependente apresenta particularidades de acordo com a região avaliada e que telencéfalo e cerebelo são regiões que podem ser estudadas com enfoque mais translacional por mimetizarem a diferença de potência dos inibidores observada em roedores.

The glutamate is the main excitatory neurotransmitter in the mammalian brain and is involved in several physiological and pathological events. One of the most important roles of astrocytes is the removal of this neurotransmitter through specific transporters (the EAATs), preventing excitotoxicity. The discovery of new drugs capable of modulating the activity and/or expression of EAATs is still emerging, targeting conditions in which EAATs play a key regulatory role in the pathogenesis process (such as attention deficit hyperactivity disorder, depression, epilepsy, Alzheimer's disease). In this context, the zebrafish has emerged as a new animal model for drug discovery and neurodegenerative diseases, complementing studies in rodents, due to the practicality of large-scale experiments. Despite advances in the study of glutamatergic signaling in zebrafish, the evaluation of transporter functionality still lacks scientific literature. Therefore, the aim of this study was to assess the glutamate uptake profile and the functionality of EAATs in different zebrafish brain structures. Brain regions (telencephalon, optic tectum, and cerebellum) were obtained by dissection and incubated with substrate (0.1, 1, 10, 100, and 1000 μM), ouabain 0.1 μM, PDC (0.01, 0.1, 1, 10, 50, and 100 μM), or TBOA (0.01, 0.1, 1, 10, and 100 μM). The telencephalon showed a Vmax value of 2.324 nmol of glu/min.mg of protein and an apparent Km of 539.7 μM. The optic tectum showed a Vmax value of 2.210 nmol of glu/min.mg of protein and an apparent Km of 740.5 μM, while the cerebellum showed a Vmax value of 2.241 nmol of glu/min.mg of protein and an apparent Km of 763.4 μM. The inhibition of glutamate uptake in the presence of 0.1 μM ouabain was 86% in the telencephalon, 89% in the optic tectum, and 91% in the cerebellum. The PDC inhibitor had an IC50 of 5.287 μM for the telencephalon, 18.99 μM for the optic tectum, and 15.30 μM for the cerebellum. TBOA showed an IC50 of 4.53 μM for the telencephalon, 16.06 μM for the optic tectum, and 0.1 μM for the cerebellum. In conclusion, sodium-dependent uptake has peculiarities depending on the evaluated region, and the telencephalon and cerebellum are regions that can be studied with a more translational focus, mimicking the potency difference of inhibitors observed in rodents.