Avaliação de pequenos RNAs regulatórios em leveduras patogênicas e seu potencial na interação patógeno-hospedeiro

Abstract

Fungos patógenos humanos vêm ganhando notoriedade epidemiológica com o atual aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, de maneira a se tornar um problema de saúde pública especialmente em países de baixa renda. Dentre os principais patógenos fúngicos cujas infecções apresentam risco de óbito ao hospedeiro encontram-se as leveduras dos gêneros Cryptococcus e Candida, que apresentam características epidemiologicamente relevantes, como a existência de linhagens hiper-virulentas no gênero Cryptococcus, capazes de infectar indivíduos imunocompetentes, assim como de linhagens resistentes aos antifúngicos disponíveis para comercialização no gênero Candida. Dada a necessidade de novos e mais eficazes tratamentos para infecções causadas por esses patógenos, a avaliação do processo de infecção é o passo inicial para a descobertas de novos mecanismos-alvo para fármacos. Enquanto que pequenos RNAs são reconhecidamente associados com a regulação de diversos processos celulares, incluindo a auto-regulação durante processos infecciosos tanto por parte do patógeno quanto do hospedeiro, pouca informação se encontra disponível quanto ao papel que essas moléculas exercem na comunicação entre patógeno e hospedeiro no contexto da infecção. Além disso, classes recentemente descobertas de pequenos RNAs, ainda pouco elucidadas, podem apresentar atuação em vias relacionadas à patogênese. Assim, um melhor entendimento dos mecanismos associados a essas moléculas é necessário, podendo ser facilitado pelo desenvolvimento de novas metodologias para identificação e estudo das mesmas. A presente tese tem por objetivo avaliar a presença de diferentes tipos de pequenos RNAs em leveduras dos gêneros Cryptococcus e Candida a fim de elucidar a associação de pequenos RNAs com mecanismos de auto-regulação celular e de interação com o hospedeiro durante infecções, além de produzir novas metodologias para a análise de pequenos RNAs. Através da metodologia in silico desenvolvida para o tratamento de dados de sRNA-seq, foram identificados fragmentos de RNA derivados de tRNAs (tRFs) em leveduras do gênero Cryptococcus em linhagens deficientes e proficientes na via de RNAi canônica, sugerindo a existência de múltiplos mecanismos associados a esses sRNAs no gênero. Além disso, foram identificados tRFs e miRNAs em vesículas extracelulares de Candida auris, assim como os possíveis alvos para esses sRNAs no conjunto de mRNAs de mamíferos. Por fim, foi desenvolvida uma nova ferramenta para a predição de tRFs in silico, com o objetivo de prover uma alternativa que una uma análise organismo-independente e com suporte estatístico à uma execução simples. Assim, a presente tese constitui base para futuras pesquisas em múltiplas linhas associadas a sRNAs regulatórios, evidenciando a existência de mecanismos celulares ainda não totalmente explorados, assim como provendo novas ferramentas para o seu estudo.

Human fungal pathogens are gaining an epidemiologic notoriety with the increased number of immunocompromised individuals, becoming a public health issue in low-income countries. Among the main fungal pathogens that produce fatal infections are yeasts from the Cryptococcus and Candida genera, which present characteristics of epidemiologic relevance, such as the existence of hypervirulent Cryptococcus lineages that are capable of infecting immunocompetent hosts, as well as lineages resistant to available antifungic in the Candida genus. Given the need for new and more effective treatments for infections with these pathogens, the evaluation of the infection process is the first step for the discovery of new target-mechanisms for drugs. While small RNAs are widely associated with the regulation of cellular processes, including self-regulation during infections in both pathogen and host, little is known about their role in the communication between pathogen and host in the context of infection. Also, recently discovered small RNA classes that are still poorly understood may play a role in the pathogenesis. Therefore, a better understanding of the mechanisms with which these molecules are associated is necessary, which might be aided by the development of new methods to identify and study them. This thesis has as its goal to evaluate the presence of different types of small RNAS in yeasts from Cryptococcus and Candida genera in order to elucidate the association of these small RNAs with cell self-regulation and infection-related host-interaction mechanisms, while also producing new methods to analyze small RNAs. Using a developed in silico methodology for sRNA-seq data filtering, tRFs were identified in both RNAi-deficient and proficient Cryptococcus lineages, suggesting that multiple mechanisms are associated with such sRNAs in this genera. Also, both tRFs and miRNAs were identified in Candida auris extracellular vesicles, as well as possible targets for these sRNAs within the mRNA set of mammalians. At last, a new tool for in silico tRF prediction was developed, aiming to provide an alternative that combines an organism-independent and statistically supported analysis with a simple execution. Hence, the present thesis constitute basis for future research in multiple lines associated with regulatory sRNAs, highlighting the existence of molecular mechanisms that are not fully understood, as well as providing new tools to study them.