Formação de biofilmes por Salmonella enteritidis, Escherichia coli e Campylobacter jejuni : aplicação de modelagem preditiva e alternativas para controle

Abstract

Salmonella Enteritidis, Escherichia coli e Campylobacter jejuni são umas das principais causas de doenças transmitidas por alimentos, sendo a carne de frango considerada uma das principais fontes de infecção para o homem. No ambiente industrial, a formação de biofilme por estes microrganismos os torna mais resistentes aos processos de higienização, aumentando sua permanência nas plantas de processamento e favorecendo a contaminação do produto final. Neste contexto, este estudo teve por objetivo caracterizar fenotipicamente a formação de biofilmes mono e multiespécies por S. Enteritidis, E. coli e C. jejuni, avaliar diferentes compostos antimicrobianos para prevenção e remoção do biofilme pré-formado, e aplicar a modelagem preditiva visando simular a adesão e a inativação de biofilmes multiespécies. A avaliação da formação de biofilme pela técnica de cristal violeta mostrou que das 33 cepas de S. Enteritidis testadas, 60% produziram biofilme a 25°C (temperatura ambiente), para E. coli, 41% formaram biofilme a 4°C (temperatura de refrigeração) e a 12°C (temperatura de sala de cortes e desossa) e para C. jejuni, 31,8% a 4°C, 12°C e a 25°C. Os ensaios de prevenção de biofilme em microplacas utilizando ácido cítrico, ácido málico e ramnolipídeo em diferentes concentrações demonstraram que todos estes compostos forneceram algum grau de prevenção a 4°C, 12°C e 25°C, independente do microrganismo. Da mesma forma, os ensaios de remoção utilizando, além dos ácidos orgânicos e do biosurfactante, o cloreto de benzalcônio, todos com cinco e dez minutos de contato, demonstraram boa atuação destas substâncias, sendo que no maior tempo de contato e nas maiores concentrações houve um melhor desempenho. De modo geral, cepas dos três microrganismos que aderiram isoladamente ao poliestireno das microplacas também o fizeram em superfícies de uso comum em matadouros – frigoríficos de aves (aço inoxidável e polietileno) sob a forma de biofilmes mono e multiespécie. Nos biofilmes multiespécie, com combinações das bactérias em duplas e em trio, E. coli apresentou maior capacidade de adesão, seguido de S. Enteritidis e, por último, C. jejuni, independente da superfície avaliada. Dos antimicrobianos testados por dez minutos nestes biofilmes formados a 4°C, 12°C e 25°C, o ácido cítrico demonstrou melhor eficácia na remoção, seguido do cloreto de benzalcônio. O tratamento com ramnolipídeo não demonstrou diferença em relação ao grupo controle. A partir dos dados gerados com os biofilmes multiespécies foi possível a obtenção de 47 modelos matemáticos com coeficiente de determinação significativo (R2), destes 20 foram de adesão e 27 de inativação. Os dados obtidos neste estudo fornecem subsídios para que a indústria avícola crie programas de controle e erradicação de biofilmes, a fim de evitar o risco de contaminação do produto final.

Salmonella Enteritidis, Escherichia coli and Campylobacter jejuni are among the main causes of foodborne diseases, and the chicken meat is considered a major source of infection for humans. In the industrial environment, the biofilm formation by these microorganisms makes them more resistant to the hygiene processes, increasing their permanence in the processing plants and favoring contamination of the final product. In this context, this study aimed to characterize phenotypically monospecies and multispecies biofilms formed by S. Enteritidis, E. coli and C. jejuni; to evaluate different antimicrobial compounds for prevention and removal of formed biofilm; and applying the predictive modeling in order to simulate adhesion and the inactivation in multispecies biofilms. The evaluation of the biofilm formation by the violet crystal technique showed that of the 33 strains of S. Enteritidis tested, 60% produced biofilm at 25°C (room temperature), for E. coli 41% formed biofilm at 4°C (refrigeration temperature) and at 12°C (room temperature for cutting and deboning) and for C. jejuni 31.8% formed biofilm at 4°C, 12°C and 25°C. Biofilm prevention tests on microplates using citric acid, malic acid and rhamnolipid at different concentrations showed that all compounds provided some degree of prevention at 4°C, 12°C and 25°C, independent of the microorganism. Likewise, removal trials using benzalkonium chloride, in addition to organic acids and biosurfactant, with five and ten minutes of contact, showed good performance of these substances. The best result was obtained with ten minuts of contact and in the highest concentrations. In general, strains of the three microorganisms that adhered alone on polystyrene from microplates also adhered on surfaces commonly used in poultry slaughterhouses (stainless steel and polyethylene) in monospecies and multispecies biofilms. In the multispecies biofilms, with combinations of the bacteria in pairs and in trios, E. coli presented greater adhesion capacity, followed by S. Enteritidis and, finally, C. jejuni, independent of the evaluated surface. Of the antimicrobials tested for ten minutes in these biofilms formed at 4°C, 12°C and 25°C, the citric acid demonstrated a better removal efficiency, followed by benzalkonium chloride. Treatment with ramnolipide did not show any difference in relation to the control group. From the data generated with the multispecies biofilms, it was possible to obtain 47 mathematical models with significant coefficient of determination (R2), 20 of these models were adherence and 27 inactivation. The data obtained in this study provide subsidies for the poultry industry to create biofilm control and eradication programs, in order to avoid the risk of contamination of the final product.