Proteína ácida fibrilar glial como potencial biomarcador da atrofia muscular espinhal : identificação a partir de abordagens bioinformáticas não enviesadas e caracterização em diferentes fluidos biológicos

Abstract

Introdução: A Atrofia Muscular Espinhal (AME) é uma doença autossômica recessiva causada por variantes patogênicas bi-alélicas no gene de sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1). Caracteriza-se pela degeneração dos motoneurônios no corno anterior da medula espinhal, resultando em atrofia e fraqueza muscular progressivas, sendo considerada a principal causa hereditária de morte infantil. Nos últimos anos, avanços na compreensão da fisiopatologia da AME possibilitaram o surgimento de novas terapias para a condição. Entretanto, ainda há dados limitados acerca de biomarcadores que possam prever a evolução da doença e a resposta às novas terapias modificadoras do curso da doença. Objetivo: Este estudo teve como objetivo investigar potenciais biomarcadores para a gravidade e o monitoramento da AME, utilizando uma abordagem não enviesada a partir de estratégias de bioinformática. Por meio dessa análise, a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) foi identificada como um potencial alvo. O GFAP é um marcador associado à reativação astrocitária e tem sido recentemente reconhecido como relevante em processos neurodegenerativos. Métodos: Foi realizada uma meta-análise de expressão gênica diferencial a partir de conjuntos de dados de 15 estudos em modelos animais transgênicos de AME em tecidos neurais. Devido à heterogeneidade dos estudos, foi realizada uma meta-count e, para as análises subsequentes, selecionaram-se apenas os genes que apresentaram expressão diferencial em comparação com controles em pelo menos três estudos. A expressão dos genes candidatos foi avaliada adicionalmente em dois bancos de dados humanos. Posteriormente, conduziu-se um estudo caso-controle, incluindo 25 pacientes com AME (11 com AME tipo 1 e 14 com AME tipos 2 ou 3; dos quais 10 estavam recebendo terapias modificadoras do curso da doença) e 24 controles pareados por idade e sexo. Em seguida, realizou-se um estudo de coorte com duração de 12 meses nos pacientes com AME. Foram analisados os níveis séricos de GFAP e de Neurofilamento de cadeia leve (NfL). Adicionalmente, avaliaram-se os níveis de GFAP no líquor de 12 dos 25 casos incluídos no estudo (9 com AME tipo 1 e 3 com AME tipos 2 e 3) e em dois sujeitos pré-sintomáticos adicionais (um com 2 cópias e outro com 4 cópias do SMN2) que haviam sido tratados com Nusinersena, sendo os níveis medidos pré (baseline) e após 6 e 14 meses do início do tratamento. Resultados: Um total de 134 genes apresentou expressão diferencial na meta-count, dos quais 122 possuíam ortólogos humanos. Dentre eles, 24 demonstraram expressão alterada nos conjuntos de dados de pacientes com AME e apenas cinco exibiram alterações consistentes de expressão entre os estudos. Destes, dois eram expressos especificamente no Sistema Nervoso Central, incluindo a GFAP. No estudo caso-controle, os níveis séricos de GFAP estavam reduzidos em pacientes com AME em comparação aos controles (p = 0,014), com variações entre os tipos de AME – sendo maiores no tipo 1 (p = 0,028) e em 8 pacientes com duas cópias de SMN2 (p = 0,03). Ademais, os níveis de GFAP encontrados eram maiores nos pacientes em uso de terapias modificadoras da doença, em comparação com aqueles naive de tratamento (p = 0,01). Já os níveis de NfL encontraram-se aumentados em pacientes com AME em relação aos controles (p = 0,009), variando conforme o tipo de AME (maiores no tipo 1, p = 0,001) e o status funcional (maiores em pacientes que não sentam, p = 0,001), além de serem mais elevados em pacientes com duas cópias de SMN2 (p = 0,016). Apenas os níveis de NfL alteraram-se após 12 meses (p = 0,02) e distinguiram de forma acurada os casos dos controles (ROC = 0,682, IC 95%: 0,32–0,832, p = 0,03). Observou-se ainda uma correlação mútua entre os níveis de GFAP e de NfL (Rho = 0,375, p = 0,013). Não foram observadas diferenças significativas nos níveis liquóricos de GFAP entre o baseline e após 6 meses (p = 0,650) ou 14 meses (p = 0,195) de tratamento. No entanto, ao se considerar apenas os pacientes com AME tipo 1 ou indivíduos pré-sintomáticos com predição de fenótipo tipo 1, observou-se uma redução significativa nos níveis de GFAP após 14 meses de tratamento (p = 0,045). Conclusão: Por meio de uma abordagem não enviesada em conjuntos de dados de expressão gênica diferencial disponíveis em repositórios públicos, identificamos o GFAP como um candidato a biomarcador de gravidade, apresentando redução na expressão nos tecidos neurais de modelos animais murinos e de pacientes com AME. A análise sérica no estudo clínico confirmou a diminuição dos seus níveis na AME, associando-os ao tipo da doença, ao número de cópias do gene SMN2 e ao status de tratamento, sendo que os níveis liquóricos mostraram redução da GFAP ao longo do tempo com o tratamento com nusinersena em pacientes com AME tipo 1 Essa identificação pioneira de um biomarcador glial ressalta o papel dos astrócitos na fisiopatologia da AME e sua associação com a neurodegeneração, conforme indicado pela correlação observada com os níveis de NfL.

Background: Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a monogenic autosomal recessive disorder caused by bi-allelic pathogenic variants in the survival motor neuron 1 (SMN1) gene. It is characterized by the degeneration of motor neurons in the anterior horn of the spinal cord, resulting in muscular atrophy and progressive weakness, and is considered the main hereditary cause of infant death. In recent years, advances have been made in understanding the pathophysiology of SMA, enabling the emergence of new treatments for the condition. However, there is still limited data regarding biomarkers that can predict disease evolution and response to these new disease-modifying therapies. Objective: This study aimed to investigate potential biomarkers for SMA severity and monitoring, using an unbiased approach with bioinformatics tools. Through this analysis, glial fibrillary acidic protein (GFAP) was identified as one of the main hits. GFAP is a marker associated with astrocyte reactivation and has recently been recognized as relevant in neurodegenerative processes. Methods: A meta-analysis of differential gene expression (DGE) was conducted using datasets from 15 studies of transgenic SMA mouse models in neural tissues. Due to the heterogeneity of the studies, a meta-count was performed. For further analysis, only genes that were differentially expressed compared to controls in at least three studies were selected. Candidate gene expression was then assessed in two human datasets. Subsequently, a case-control study was carried out, including 25 SMA patients (11 with SMA type 1 and 14 with types 2 or 3; 10 of whom were receiving disease-modifying therapies) and 24 age- and sex-matched controls. This was followed by a 12-month cohort study of the SMA patients, in which serum levels of GFAP and Neurofilament Light Chain (NfL) were analyzed. Additionally, GFAP levels in the cerebrospinal fluid (CSF) were analyzed in 12 of the 25 included patients (9 with SMA type 1 and 3 with types 2 or 3) and 2 additional pre-symptomatic individuals (one with 2 and the other with 4 SMN2 copies) immediately before (baseline) and up to 6 and 14 months after treatment with Nusinersen. Results: A total of 134 genes were differentially expressed in the metacount, 122 of which had human orthologs. Among them, 24 showed altered expression in SMA patient datasets and only five exhibited consistent expression changes across studies. Of these, two were specifically expressed in the central nervous system, including GFAP. Serum GFAP levels were reduced in SMA patients compared to controls (p=0.014), with differences across SMA types— being higher in type 1 (p=0.028) and in patients with two SMN2 copies (p=0.03). GFAP levels were also higher 10 in treated patients at baseline (p=0.01). NfL levels were increased in SMA patients compared to controls (p=0.009), varied by SMA type (higher in type 1, p=0.001) and functional status (higher in non-sitters, p=0.001), and were higher in patients with two SMN2 copies (p=0.016). Only NfL changed after 12 months (p=0.02) and accurately distinguished cases from controls (ROC=0.682, 95% CI 0.32–0.832, p=0.03). GFAP and NfL levels were mutually correlated (Rho=0.375, p=0.013). No significant differences in CSF GFAP levels were observed between baseline and 6 months (p = 0.650) or 14 months (p = 0.195) of treatment. However, when considering only patients with SMA type 1 or pre-symptomatic individuals predicted to develop SMA type 1, a significant reduction in GFAP levels was observed after 14 months of treatment (p = 0.045). Conclusion: Through an unbiased approach using differentially expressed gene datasets available in public repositories, we identified GFAP as a candidate severity biomarker, showing reduced expression in neural tissues of murine animal models and patients with SMA. The serum analysis in the clinical study confirmed its decreased levels in SMA, linking them to disease type, SMN2 copy number, and treatment status. Additionally, CSF levels showed a reduction in GFAP over time with nusinersen treatment in patients with SMA type 1. This pioneering identification of a glial biomarker highlights the role of astrocytes in SMA pathophysiology and their association with neurodegeneration, as indicated by the observed correlation with NfL levels.