Efeitos de probióticos e do butirato frente à disfunção cerebral induzida pela hipercolesterolemia : uma abordagem in vivo e in vitro

Abstract

Nas últimas décadas o aumento de colesterol no plasma vem sendo associado a alterações cerebrais características de demência e transtornos de humor. Alterações no metabolismo do colesterol podem impactar negativamente o funcionamento cerebral, contribuindo para déficits comportamentais e neuroquímicos. Além disso, a microbiota intestinal possui uma conexão bidirecional com o cérebro, sendo implicada em condições neurológicas como a depressão — sintoma frequente e fator predisponente de demências, tais como a doença de Alzheimer. Evidências crescentes indicam que a microbiota e seus metabólitos, como os ácidos graxos de cadeia curta, desempenham um papel fundamental na regulação do metabolismo e da função cerebral, representando alvos promissores para intervenções terapêuticas. Os probióticos, então, surgem como uma estratégia potencial para a modulação da microbiota intestinal e prevenção dos efeitos deletérios da hipercolesterolemia no cérebro. Dessa forma, esta dissertação teve como objetivo avaliar os efeitos neuroprotetores de um blend probiótico (mistura probiótica contendo diferentes cepas bacterianas) e de seus metabólitos sobre alterações metabólicas, comportamentais e neuroinflamatórias induzidas pela hipercolesterolemia, tanto em um modelo in vivo utilizando camundongos quanto in vitro com uma linhagem de células neuronais com ênfase nos mecanismos celulares e moleculares associados à função cerebral. Para isso, camundongos machos CF-1 com 3 meses de idade foram alimentados com dieta padrão (SD) ou dieta hipercolesterolêmica (HCD; 2,5% de colesterol) por 60 dias e tratados por gavagem com solução salina (0,9%) ou blend de probióticos (1×10⁹ UFC/kg). Durante o protocolo, foram monitorados peso corporal e consumo de ração. No final, os animais foram submetidos a teste comportamental, análises bioquímicas e moleculares, imunofluorescência cerebral, e coleta/pesagem de tecidos periféricos. Os camundongos alimentados com uma dieta rica em colesterol apresentaram um aumento significativo nos níveis plasmáticos totais de colesterol, sem alteração com o tratamento probiótico. A dieta rica em colesterol promoveu aumento de peso nos animais; no entanto, esse aumento não foi observado no grupo tratado com probiótico. As análises comportamentais revelaram fenótipo depressivo nos animais hipercolesterolêmicos, o qual foi prevenido pelo tratamento com probiótico. O tratamento com probiótico nos animais expostos a dieta rica em colesterol foi capaz de aumentar a expressão gênica da sinaptofisina em comparação aos animais que receberam a mesma dieta e salina, indicando um efeito promotor na integridade sináptica. Os animais hipercolesterolêmicos também apresentaram aumento da imunorreatividade para GFAP nas sub-regiões CA1 e giro denteado (DG) do hipocampo. Curiosamente, os animais alimentados com a dieta hipercolesterolêmica e tratados com probiótico apresentaram um quadro de microgliose em todas as regiões do hipocampo em relação ao grupo que recebeu dieta rica em colesterol e salina. Complementarmente, in vitro, observamos que o LDL induziu um aumento na formação de gotículas lipídicas na linhagem neuronal HT-22, o que é prejudicial para essas células. Notavelmente, o butirato — um ácido graxo de cadeia curta, produto das bactérias presentes no blend probiótico utilizado — preveniu a formação de gotículas lipídicas nessas células. Assim, nossos achados reforçam a associação entre hipercolesterolemia e disfunção cerebral, e indicam que a modulação da microbiota intestinal por meio de probióticos e seus metabólitos, como o butirato, representa uma estratégia promissora para prevenir os efeitos deletérios do excesso de colesterol sobre o cérebro.

In recent decades, increased plasma cholesterol has been associated with brain alterations characteristic of dementia and mood disorders. Disruptions in cholesterol metabolism can negatively impact brain function, contributing to behavioral and neurochemical deficits. Furthermore, the gut microbiota has a bidirectional connection with the brain and has been implicated in neurological conditions such as depression — a common symptom and predisposing factor of dementias, including Alzheimer's disease. Growing evidence suggests that the microbiota and its metabolites, such as short-chain fatty acids (SCFAs), play a fundamental role in regulating metabolism and brain function, representing promising targets for therapeutic interventions. Probiotics, therefore, emerge as a potential strategy for modulating the gut microbiota and preventing the deleterious effects of hypercholesterolemia on the brain. Accordingly, this dissertation aimed to evaluate the neuroprotective effects of a probiotic blend (a probiotic mixture containing different bacterial strains) and its metabolites on metabolic, behavioral, and neuroinflammatory alterations induced by hypercholesterolemia, both in an in vivo mice model and an in vitro neuronal cell line, with emphasis on cellular and molecular mechanisms associated with brain function. To this end, 3-month-old male CF-1 mice were fed a standard diet (SD) or a high-cholesterol diet (HCD; 2.5% cholesterol) for 60 days and treated daily by gavage with either saline solution (0.9%) or a probiotic blend (1×10⁹ CFU/kg). Throughout the protocol, body weight and food intake were monitored. At the end of the experiment, animals underwent behavioral testing, biochemical and molecular analyses, brain immunofluorescence, and collection/weighing of peripheral tissues. Mice fed the highcholesterol diet showed a significant increase in total plasma cholesterol levels, which was not altered by probiotic treatment. The high-cholesterol diet promoted weight gain in the animals; however, this increase was not observed in the group treated with probiotic. Behavioral analyses revealed depressive-like phenotypes in hypercholesterolemic mice, which were prevented by probiotic treatment. In animals exposed to the high-cholesterol diet, probiotic administration increased synaptophysin gene expression compared to those receiving the same diet with saline, indicating a beneficial effect on synaptic integrity. Hypercholesterolemic animals also showed increased GFAP immunoreactivity in the CA1 and dentate gyrus (DG) subregions of the hippocampus. Interestingly, animals fed the high-cholesterol diet and treated with probiotics exhibited increased microgliosis across all hippocampal regions when compared to the group receiving the same diet with saline. Complementarily, in vitro, we observed that LDL induced an increase in lipid droplet formation in the HT-22 neuronal cell line, which is harmful to these cells. Notably, butyrate — a short-chain fatty acid produced by bacteria present in the probiotic blend — prevented lipid droplet formation in these cells. Taken together, our findings reinforce the association between hypercholesterolemia and brain dysfunction and suggest that modulation of the gut microbiota through probiotics and their metabolites, such as butyrate, represents a promising strategy to prevent the deleterious effects of excess cholesterol on the brain.