Alterações neuroquímicas e comportamentais induzidas pela exposição à prolina em peixe-zebra (Dano rerio)

Abstract

A hiperprolinemia é uma doença metabólica que pode ser causada por dois distintos erros inatos do metabolismo da prolina. A hiperprolinemia tipo I ocorre por uma deficiência na enzima prolina oxidase, enquanto que a hiperprolinemia tipo II é causada pela ausência da atividade da enzima Δ1-pirrolino-5-carboxilato desidrogenase. Os pacientes afetados por essa doença geralmente apresentam manifestações neurológicas, tais como convulsões, déficit cognitivo e retardo mental. Além disso, tem sido descrita uma associação entre a hiperprolinemia moderada e doenças psiquiátricas. Entretanto, os mecanismos neuroquímicos relacionados a esses sintomas neurológicos ainda são pouco compreendidos. Portanto, no presente estudo, investigamos o efeito da exposição aguda e crônica à prolina sobre parâmetros comportamentais em peixe-zebra, tais como: atividade locomotora, ansiedade e interação social. Além disso, avaliamos o efeito in vivo e in vitro da prolina sobre a atividade da acetilcolinesterase (AChE), bem como sobre a atividade e expressão gênica das ectonucleotidases em cérebro de peixe-zebra. Para os estudos in vivo, os animais foram expostos a duas concentrações de prolina (1,5 e 3,0 mM) durante 1 hora ou 7 dias (tratamento agudo e crônico, respectivamente). Para os ensaios in vitro, diferentes concentrações de prolina foram testadas (variando de 3,0 a 1000 μM). A exposição aguda à prolina não promoveu alterações significativas nos parâmetros bioquímicos e comportamentais analisados. Entretanto, a exposição crônica à prolina na concentração de 1,5 mM provocou um aumento na atividade locomotora do peixe-zebra, caracterizada pelo aumento no número de linhas cruzadas (47%), na distância total percorrida (29%) e na velocidade média (33%). Um aumento significativo no tempo gasto na parte superior do aquário (91%) também foi observado após esse mesmo tratamento, o que pode ser interpretado como um comportamento ansiolítico. A prolina na concentração de 1,5 mM também induziu o déficit de interação social (78%), quando comparado ao grupo controle. Além disso, exposição crônica aumentou significativamente a atividade da AChE em ambos os grupos tratados (34% e 39%). Esse mesmo tratamento também aumentou a hidrólise de ATP em ambas as concentrações testadas (14% e 22%, respectivamente), enquanto que a hidrólise de ADP e AMP aumentou apenas na concentração de 3,0 mM (21% e 17%, respectivamente). A expressão gênica da E-NTPDase3 aumentou em ambos os grupos tratados após a exposição crônica à prolina, enquanto que a E-NTPDase1 teve seus níveis de transcritos aumentados apenas na concentração de 3,0 mM. A prolina, quando avaliada in vitro, não promoveu alterações significativas nas atividades das ectonucleotidase e da AChE. Por fim, demonstramos, ainda, que as alterações comportamentais e o aumento da atividade da AChE induzidos pela prolina foram completamente revertidos pela administração aguda de um antipsicótico atípico (sulpirida), mas não por um típico (haloperidol). Em conjunto, estes dados demonstram que a exposição crônica à prolina induz alterações comportamentais, bem como aumenta a atividade da AChE e catabolismo de nucleotídeos em cérebro de peixe-zebra. Esses achados podem contribuir, pelo menos em parte, para uma melhor compreensão dos mecanismos relacionados às manifestações neurológicas verificadas em pacientes hiperprolinêmicos, como os transtornos psicóticos e cognitivos. Além disso, este estudo pode facilitar o uso do peixe-zebra como modelo experimental para o estudo de erros inatos do metabolismo que afetam o sistema nervoso central.

Hyperprolinemia is a metabolic disease that may be caused by two distinct inborn errors of proline metabolism. Hyperprolinemia type I occurs by a deficiency in proline oxidase, while the hyperprolinemia type II is caused by an absence of Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid dehydrogenase. Patients affected by this disease usually present neurological manifestations, such as seizures, cognitive impairment, and mental retardation. Moreover, an association between psychiatry disorders and moderate hyperprolinemia has been reported. However, the mechanisms related to these neurological symptoms still remain poorly understood. Therefore, in the present study, we investigated the effect of short- and long-term proline exposure on behavioral parameters in zebrafish, such as locomotor activity, anxiety, and social interaction. In addition, we evaluated the in vivo and in vitro effects of proline on acetylcholinesterase (AChE) activity, as well as on ectonucleotidase activities and gene expression in zebrafish brain. For the in vivo studies, animals were exposed at two proline concentrations (1.5 and 3.0 mM) during 1 hour or 7 days (short- or long-term treatments, respectively). For the in vitro assays, different proline concentrations (ranging from 3.0 μM to 1000 μM) were tested. Short-term proline exposure did not promote significant changes on the behavioral and biochemical parameters analyzed. Long-term exposure at 1.5 mM proline caused an increase in locomotor activity in zebrafish, characterized by an increase in the number of line crossings (47%), in the total distance traveled (29%), and in the mean speed (33%). A significant increase in the time spent in the upper portion of the test tank was also observed after the same treatment (91%), which may be interpreted as an indicator of anxiolytic behavior. Proline at 1.5 mM also induced social interaction impairment (78%), when compared to the untreated group. Moreover, long-term proline exposure significantly increased AChE activity for both treated groups (34% and 39%). This treatment also increased ATP catabolism in both concentrations tested (14% and 22%, respectively), whereas ADP and AMP hydrolysis were increased only at 3.0 mM proline (21% and 17%, respectively). The gene expression of E-NTPDase3 increased in both treated groups after long-term proline, whereas E-NTPDase1 transcript levels increased only at concentration of 3.0 mM. Proline, when assessed in vitro, did not promote significant changes on AChE and ectonucleotidase activities. At last, we demonstrated the proline-induced behavioral changes and increase in AChE activity were completely reversed by acute administration of an atypical antipsychotic drug (sulpiride), but not by a typical (haloperidol). Altogether, these data demonstrate that long-term proline exposure induces behavioral changes as well as increases AChE activity and nucleotide catabolism in zebrafish brain. These findings may contribute, at least in part, to better understand the mechanisms related to the neurological manifestations observed in hyperprolinemic patients, such as the psychotic and cognitive dysfunctions. Moreover, this study might facilitate the use of the zebrafish as experimental model for studying inborn errors of amino acid metabolism that affect the central nervous system.