Bioprospecção de uma substância antifúngica potencialmente nova produzida por actinomicetos isolados no RS

Abstract

Os fungos dermatófitos e as leveduras do gênero Candida são alguns dos microrganismos responsáveis por micoses em humanos. O tratamento dessas doenças acaba se tornando difícil pelo baixo número de antifúngicos existentes no mercado e pelo surgimento de resistência destes às drogas utilizadas. Já as actinobactérias são conhecidas por produzirem uma grande variedade de metabólitos secundários. Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica dos metabólitos secundários produzidos por isolados de actinomicetos contra fungos dermatófitos e espécies de Candida sp. de origem clínica. Para a seleção dos isolados de actinomicetos com o melhor potencial de inibição foi realizado o ensaio de dupla camada em meio ágar amido caseína (ACA). Os isolados que mostraram atividade foram submetidos aos ensaios para a otimização da produção do composto ativo em sistema de cultura submersa. Para isso, foram avaliados diferentes meios de cultura, diferentes temperaturas e diferentes faixas de pH. A atividade antifúngica foi avaliada a cada 24h durante oito dias e observada através do ensaio de difusão em poço, onde foi calculado o índice de antibiose (IA). Nenhum dos isolados de fungos dermatófitos foi inibido no ensaio de dupla camada e os isolados 1S, R18(6) e 6(2) demonstraram atividade frente todas as espécies de Candida testadas. O isolado R18(6) mostrou melhor atividade em cultura líquida, sendo que as melhores condições de cultivo para a produção do antifúngico foi meio AC sem controle de pH, temperatura de 30°C e crescimento por 72h. Foram realizados ensaios como a concentração inibitória mínima, teste de termoestabilidade e avaliação do efeito de enzimas na atividade antifúngica do extrato bruto. O extrato bruto padronizado foi submetido à cromatografia de camada delgada (CCD) com diferentes solventes e o ensaio de autobiografia foi realizado para verificar a banda com atividade antifúngica. O composto ativo foi observado em um Rf de 0,35 quando utilizado como solvente a mistura de butanol/ ácido acético/ água. Após identificar a banda com atividade antifúngica foram realizados testes de coloração da CCD com cloreto férrico, ninhidrina e anisaldeído para identificação parcial do composto ativo. O resultado sugere que o composto não possui hidroxilas ligadas a anel aromático, não apresenta grupo amino livre e possivelmente alguma parte da molécula tenha um anel heterocíclico com nitrogênio ligado. Também, foi realizada a caracterização morfológica do isolado R18(6) através de microcultivo e microscopia eletrônica de varredura (MEV) e foram observadas estruturas características do gênero Streptomyces.

The dermatophytes fungi and Candida species are some of the microorganisms responsible for mycoses in humans. The treatment of these diseases eventually becomes difficult by the low number of antifungal agents in the market and by the emergence of resistance to the drugs available today. The actinobacteria are known by producing different secondary metabolites. This study aimed to evaluate the antifungal activity of secondary metabolites produced by actinomycetes isolates against fungal pathogens of clinical origin. For the selection of actinomycetes isolates with the best potential inhibition the assay of double layer was performed on starch casein agar (SCA). The isolates that showed activity were submitted to an optimization of the active compound production in submerged culture system. In order to do so, different culture media, temperatures and pH ranges were assessed. The antifungal activity was evaluated every 24 hours for eight days and activity was observed by well diffusion assay, where the antibiosis index was calculated. None of the dermatophyte isolates were inhibited in the double layer assay. Isolates 1S, R18(6) and 6(2) of the actinobacteria demonstrated activity against all the tested Candida species. Isolate R18(6) showed the highest activity in liquid culture and the best growing conditions for producing the antifungal compound was media starch casein broth , without pH control, temperature of 30°C with 72h of cell growth. Assays were performed as the minimum inhibitory concentration, thermal stability test and the effect of different enzymes on antifungal activity of the crude extract. The crude extract was subjected to standardized thin layer chromatography (TLC) with different solvents and an autobiography assay was conducted to verify band with antifungal activity. The active compound was observed at an Rf of 0.35 when the solvent mixture of butanol/ acetic acid/ water was used. After identifying the band with antifungal activity CCD coloring tests were performed with ferric chloride, anisaldehyde and ninhydrin for partial identification of the active compound; it has been observed that the compound does not have hydroxyl groups attached to the aromatic ring, it has no free amino group and possibly some part of the molecule has a linked nitrogen heterocyclic ring. Also, we performed a morphological characterization of the isolate R18 (6) through microcultive and scanning electron microscopy and structures have been observed characteristics of the genus Streptomyces.