Padronização das condições de adesão de células de hiperplasia prostática benigna (HPB) em matrizes tridimensionais

Abstract

Hiperplasia prostática benigna (HPB) é um distúrbio proliferativo com alta prevalência na população masculina, associado a uma série de complicações urinárias e redução da qualidade de vida. Sua etiologia ainda é pouco compreendida, mas historicamente a investigação in vitro dos mecanismos envolvidos na sua gênese baseiam-se em modelo de cultura celular em placa 2D. Entretanto, já foi demonstrado que esse modelo não é capaz de simular a complexidade existente no tecido prostático. In vivo, as células e a matriz extracelular (MEC) interagem de forma complexa e bidirecional, regulando processos como diferenciação, proliferação, sobrevivência e migração das células. As células aderem-se à matriz extracelular principalmente através da ligação das integrinas a proteínas da MEC como colágeno, fibronectina, vitronectina e laminina. Tem sido demonstrado que vários tipos celulares in vitro dependem da adsorção inicial de fibronectina e vitronectina do soro para adesão e proliferação em diversos materiais sintéticos. Ainda, como cada tecido é circundado por um ambiente próprio, é desejável que se simulem essas características particulares para cada aplicação, com diversos biomateriais sintéticos e naturais testados para suportar o cultivo 3D. Entre as matrizes naturais, materiais como colágeno e glicosaminoglicanos são amplamente utilizados e apresentam inúmeras vantagens. Então, existe um grande interesse em encontrar um modelo tridimensional que represente de forma mais fidedigna cada ambiente tecidual encontrado in vivo. Assim, este trabalho teve como objetivo padronizar as condições de adesão de células de pacientes com HPB em relação às modificações de concentração meio de cultivo/soro, do número de células semeadas e da composição da matriz temporária, para a qual também foi verificada a capacidade de proliferação celular. Para testar a influência da adição de soro fetal bovino (SFB) no meio de cultivo sobre a adesão celular, as células foram semeadas em matriz de colágeno nas seguintes condições: DMEM, DMEM com SFB 10%, DMEM com SFB 40% ou SFB puro. Na segunda etapa, verificou-se a eficiência da adesão para diferentes densidades de células por área de matriz: 10 mil, 20 mil, 50 mil ou 100 mil células por cm2. Na terceira etapa, as seguintes composições de matrizes temporárias foram testadas: colágeno, colágeno com ácido hialurônico, colágeno com heparina e mistura dos três substratos. Após o período de adesão de 1 hora, as células tiveram o núcleo marcado com Hoechst 33342, e foram capturadas seis imagens de cada matriz em microscópio de fluorescência. As células foram contadas em cada imagem. Na análise estatística para um n = 18 (por grupo), foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis, com teste de comparações múltiplas de Dunn, para os dois primeiros ensaios de adesão e teste GEE para análise da composição da matriz. Foi considerado o nível de significância de P < 0,05. Como resultados, encontramos que a presença de SFB no meio de cultivo prejudicou a adesão, que para um grande número de células semeadas o número de células aderidas foi maior, mas a eficiência de adesão piorou, e que a matriz com ácido hialurônico favoreceu a adesão celular. As células também proliferaram nas diferentes matrizes temporárias.